動態(tài)高壓微射流技術(shù)對胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶性質(zhì)和構(gòu)象變化的影響.pdf

1、動態(tài)高壓微射流技術(shù)(Dynamic high-pressure microfluidization,DHPM)是一種新興的非熱加工技術(shù),可以對物料進行高速剪切、高頻振蕩、瞬時壓力降、膨爆和氣穴等一系列作用,其工作壓力可以在很短的時間內(nèi)達到200 MPa。本課題研究了DHPM對胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶的活性、穩(wěn)定性和構(gòu)象變化的影響,初步探討了性質(zhì)變化與構(gòu)象變化之間的關(guān)系。
　　 以豬胰蛋白酶為對象,對其性質(zhì)和構(gòu)象分析表明,胰蛋白酶最適

2、反應(yīng)溫度為35℃,最適pH7.6,屬于堿性蛋白酶,并且具有較好的熱穩(wěn)定性以及堿性條件下的pH穩(wěn)定性,45℃保溫100min后,胰蛋白酶殘留活性為86％。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶相對分子質(zhì)量約24 kDa。游離巰基和總巰基含量分別是6.21±0.4和12.7±0.22μmol/g。DSC分析表明,胰蛋白酶變性溫度為93℃。胰蛋白酶最大紫外吸收峰在280 nm,熒光吸收峰在350 nm。
　　 通過研究DHPM對胰蛋白酶活性

3、、反應(yīng)穩(wěn)定性和構(gòu)象變化的影響,發(fā)現(xiàn):DHPM對胰蛋白酶的活性沒有顯著影響,80、100和120 MPa處理后,胰蛋白酶相對活性分別保留98.5％、98.3％和97.8％。經(jīng)160 MPa的高壓力處理后,活性仍保留97％。DHPM顯著提高了胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性,45℃保溫100 min后,經(jīng)DHPM80 MPa處理的胰蛋白酶相對活性提高至96％;DHPM對胰蛋白酶最適pH值沒有影響,然而,經(jīng)DHPM100和120 MPa處理后,

4、胰蛋白酶在最適pH下活性有所提高,相對活性分別為102％和103％。構(gòu)象變化分析發(fā)現(xiàn),DHPM處理后胰蛋白酶游離巰基含量升高,總巰基含量降低,表明DHPM處理導(dǎo)致胰蛋白酶分子發(fā)生了去折疊。此外,紅外光譜中α-螺旋強度降低也印證了上述觀點。紫外吸收強度降低和熒光強度增強表明胰蛋白酶分子中酌氨酸和色氨酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生了變化,埋藏在分子內(nèi)部的疏水基團逐漸暴露。進一步采用Pymol對天然胰蛋白酶和去折疊胰蛋白酶的分子構(gòu)象進行模擬,直觀地顯

5、示了DHPM處理導(dǎo)致胰蛋白酶結(jié)構(gòu)較為松散,分子發(fā)生部分去折疊。
　　 以莖菠蘿蛋白酶為原料,研究DHPM對其活性、穩(wěn)定性的影響。結(jié)果顯示:DHPM對菠蘿蛋白酶具有鈍化作用,但活力并不隨著壓力的升高而降低。壓力為60、80、100、120 MPa時,菠蘿蛋白酶的活力分別是94％、93％、98％及92％。DHPM不同壓力對菠蘿蛋白酶的最適反應(yīng)溫度的影響不同,但對最適pH值幾乎沒有影響。然而經(jīng)DHPM60、120 MPa處理后,菠蘿蛋

6、白酶在pH8.0的穩(wěn)定性顯著增強。在pH8.0保溫40 min后,60、120 MPa處理的菠蘿蛋白酶相對活力分別為85％和82％,分別比未經(jīng)處理的高14％和11％。可見,DHPM60、120 MPa處理極大地提高了菠蘿蛋白酶在pH8.0時的穩(wěn)定性。
　　 DHPM對莖菠蘿蛋白酶構(gòu)象變化影響表明:DSC掃描發(fā)現(xiàn)DHPM處理后菠蘿蛋白酶吸熱峰消失。采用紫外光譜和熒光光譜等對DHPM處理后的菠蘿蛋白酶的構(gòu)象分析表明:DHPM導(dǎo)致菠蘿