動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)對(duì)胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶性質(zhì)和構(gòu)象變化的影響.pdf

1、動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)(Dynamic high-pressure microfluidization,DHPM)是一種新興的非熱加工技術(shù),可以對(duì)物料進(jìn)行高速剪切、高頻振蕩、瞬時(shí)壓力降、膨爆和氣穴等一系列作用,其工作壓力可以在很短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到200 MPa。本課題研究了DHPM對(duì)胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶的活性、穩(wěn)定性和構(gòu)象變化的影響,初步探討了性質(zhì)變化與構(gòu)象變化之間的關(guān)系。
　　 以豬胰蛋白酶為對(duì)象,對(duì)其性質(zhì)和構(gòu)象分析表明,胰蛋白酶最適

2、反應(yīng)溫度為35℃,最適pH7.6,屬于堿性蛋白酶,并且具有較好的熱穩(wěn)定性以及堿性條件下的pH穩(wěn)定性,45℃保溫100min后,胰蛋白酶殘留活性為86％。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶相對(duì)分子質(zhì)量約24 kDa。游離巰基和總巰基含量分別是6.21±0.4和12.7±0.22μmol/g。DSC分析表明,胰蛋白酶變性溫度為93℃。胰蛋白酶最大紫外吸收峰在280 nm,熒光吸收峰在350 nm。
　　 通過(guò)研究DHPM對(duì)胰蛋白酶活性

3、、反應(yīng)穩(wěn)定性和構(gòu)象變化的影響,發(fā)現(xiàn):DHPM對(duì)胰蛋白酶的活性沒(méi)有顯著影響,80、100和120 MPa處理后,胰蛋白酶相對(duì)活性分別保留98.5％、98.3％和97.8％。經(jīng)160 MPa的高壓力處理后,活性仍保留97％。DHPM顯著提高了胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性,45℃保溫100 min后,經(jīng)DHPM80 MPa處理的胰蛋白酶相對(duì)活性提高至96％;DHPM對(duì)胰蛋白酶最適pH值沒(méi)有影響,然而,經(jīng)DHPM100和120 MPa處理后,

4、胰蛋白酶在最適pH下活性有所提高,相對(duì)活性分別為102％和103％。構(gòu)象變化分析發(fā)現(xiàn),DHPM處理后胰蛋白酶游離巰基含量升高,總巰基含量降低,表明DHPM處理導(dǎo)致胰蛋白酶分子發(fā)生了去折疊。此外,紅外光譜中α-螺旋強(qiáng)度降低也印證了上述觀點(diǎn)。紫外吸收強(qiáng)度降低和熒光強(qiáng)度增強(qiáng)表明胰蛋白酶分子中酌氨酸和色氨酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生了變化,埋藏在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)逐漸暴露。進(jìn)一步采用Pymol對(duì)天然胰蛋白酶和去折疊胰蛋白酶的分子構(gòu)象進(jìn)行模擬,直觀地顯

5、示了DHPM處理導(dǎo)致胰蛋白酶結(jié)構(gòu)較為松散,分子發(fā)生部分去折疊。
　　 以莖菠蘿蛋白酶為原料,研究DHPM對(duì)其活性、穩(wěn)定性的影響。結(jié)果顯示:DHPM對(duì)菠蘿蛋白酶具有鈍化作用,但活力并不隨著壓力的升高而降低。壓力為60、80、100、120 MPa時(shí),菠蘿蛋白酶的活力分別是94％、93％、98％及92％。DHPM不同壓力對(duì)菠蘿蛋白酶的最適反應(yīng)溫度的影響不同,但對(duì)最適pH值幾乎沒(méi)有影響。然而經(jīng)DHPM60、120 MPa處理后,菠蘿蛋

6、白酶在pH8.0的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。在pH8.0保溫40 min后,60、120 MPa處理的菠蘿蛋白酶相對(duì)活力分別為85％和82％,分別比未經(jīng)處理的高14％和11％?？梢?jiàn),DHPM60、120 MPa處理極大地提高了菠蘿蛋白酶在pH8.0時(shí)的穩(wěn)定性。
　　 DHPM對(duì)莖菠蘿蛋白酶構(gòu)象變化影響表明:DSC掃描發(fā)現(xiàn)DHPM處理后菠蘿蛋白酶吸熱峰消失。采用紫外光譜和熒光光譜等對(duì)DHPM處理后的菠蘿蛋白酶的構(gòu)象分析表明:DHPM導(dǎo)致菠蘿