胰蛋白酶的定向固定化研究.pdf

1、建立了通過虛擬篩選得到的親和配基，將胰蛋白酶定向的固定化到載體表面的新型固定化酶制備方法。通過對接軟件Autodock4.0和FlexX對胰蛋白酶的目標(biāo)位點進(jìn)行對接篩選，得到以最低自由能對接到目標(biāo)位點的五種小分子(蔗糖、2-硝基苯基β-D-葡糖苷、海藻糖、麥芽糖、纖維二糖)，同時選定一種對接失敗分子(乙二醇)作為陰性對照。通過色譜方法初步驗證小分子對胰蛋白酶的親和作用。色譜條件為：流動相流速0.3ml/min，進(jìn)樣量0.1ml。小分子在

2、蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測到的信號峰面積在與胰蛋白酶混合后，有明顯降低，證明小分子與胰蛋白酶間存在吸附作用。建立制備偶聯(lián)有五種親和配基的親和載體的方法。為降低配基和胰蛋白酶結(jié)合的空間位阻，在載體表面連接乙二醇二縮水甘油醚間隔臂，同時引入環(huán)氧基活化集團(tuán)?；罨磻?yīng)條件25℃，170rpm，反應(yīng)時間10h，活化環(huán)氧基密度達(dá)到51mmol/L以上。配基偶聯(lián)至活化載體的反應(yīng)條件40℃，170rpm，反應(yīng)時間4h。經(jīng)傅立葉變換紅外檢測可知，配

3、基成功偶聯(lián)到載體表面。通過實驗方法得到酶和載體的最佳固定化反應(yīng)條件(酶和載體量之比90mg/g，固定化時間4h)，吸附效果最好的親和載體為纖維二糖親和載體，最高酶載量達(dá)9.43mg/g。
　　 對制得的固定化胰蛋白酶活性進(jìn)行測定，采用水解底物N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)法。2-硝基苯基β-D-葡糖苷親和載體固定化的胰蛋白酶比活力最高，達(dá)到300.32U/mg，單位載體酶活達(dá)到340.77U/g，活性回收率達(dá)2.40％。