最適pH降低的中性蛋白酶I基因在米曲霉中的表達.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、米曲霉（Aspergillus oyzae）能夠分泌高活力的酶，因而被長時間應用在傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)中。米曲霉中性蛋白酶（neutral protease）的分解作用將原料中的蛋白質(zhì)發(fā)酵水解成多種氨基酸。本研究以米曲霉中性蛋白酶I(NPI)作為對象，分析糖基化對蛋白酶活力的影響，并進一步構(gòu)建食品級高活力的中性蛋白酶基因米曲霉工程菌。主要研究內(nèi)容如下：
　　1對中性蛋白酶進行三維結(jié)構(gòu)模擬，分析發(fā)生突變的位置，發(fā)現(xiàn)糖基化位點都發(fā)生在蛋

2、白酶表面。利用定點突變技術(shù)獲得了表達載體pPIC9K-NPI-P56Y-6His和pPIC9K-NPI-N41AP56Y-6His，轉(zhuǎn)入畢赤酵母Gs115。利用BMGY/BMMY培養(yǎng)基誘導蛋白表達，分別在60 h和72 h達到最大酶活42U/mL和60U/mL。對表達的蛋白酶進行硫酸銨沉淀和鎳柱純化，SDS-PAGE分析得蛋白分子量大小分別為70 KDa和50 KDa左右。對中性蛋白酶的活力進行測定：rNPI的酶活為217 U/mg，r

3、NPI-P56Y的酶活為242 U/mg，rNPI-N41AP56Y的酶活為147 U/mg。
　　2以尿嘧啶依賴的米曲霉工程菌AS11為出發(fā)菌株，以0.8M NaCl溶液作為滲透壓緩沖液制備米曲霉原生質(zhì)體，原生質(zhì)體濃度達到8.5×106個/mL，再生率為22％。構(gòu)建了打靶載體 pNP-NPI-6His、pNP-NPI-Y122FK246ID382V-6His和pNP-NPI-Y122FK246ID382VY186S-6His。轉(zhuǎn)

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