鈣激活中性蛋白酶作為抑制肝癌細胞轉移靶點的效用研究.pdf

1、目的: 觀察Calpain的相關抑制劑對不同轉移能力肝癌細胞遷移浸潤能力和肝癌細胞信號通路相關蛋白表達及活性的影響，進一步認識肝癌轉移分子機制，為臨床防治肝癌的轉移復發(fā)提供依據(jù)。
　　方法: （1）用Western blot檢測3株不同轉移能力肝癌細胞（MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2）和1株正常肝細胞（HL-7702）中Calpain-1及Calpain-2表達，篩選與肝癌轉移有關的Calpain的亞家族成員；（2

2、）用ALLM、Calpain inhibitor IV、Calpain inhibitor VI、Calpastatin四種Calpain抑制劑，分別給予高、中、低三種濃度預處理MHCC97-H肝癌細胞24h、48h及72h，用Western blot方法觀察Calpain-2的表達及剪切活性，選擇4種抑制劑的最適濃度和作用時間；(3)用4種抑制劑的最適濃度和作用時間處理肝癌細胞和正常肝細胞，觀察4種抑制劑對肝癌細胞信號通路相關蛋白 S

3、rc、FAK、及 Dicer的表達，通過劃痕實驗檢測對細胞遷移能力的影響，Transwell實驗檢測對細胞侵襲能力的影響。
　　結果: (1)與正常肝細胞HL-7702相比，Calpain-1在4種肝細胞中表達無統(tǒng)計學差異（P>0.05），Calpain-2在3種肝癌細胞中表達上調（P<0.05）,有轉移能力的肝癌細胞中Calpain-2的表達上調（P<0.01）。(2)4種高濃度Calpain-2抑制劑（ALLM、Calpain

4、 inhibitor IV、Calpain inhibitor VI、Calpastatin）分別處理 MHCC97-H細胞72 h，都使Calpain-2的表達下調（P<0.05或P<0.01）。(3)高濃度ALLM和Calpain inhibitor VI處理3種肝癌細胞和1種正常肝細胞72h后，與正常肝細胞相比，具有轉移能力肝癌細胞MHCC97-H和MHCC97-L中SRC、FAK表達上調（P<0.01），Dicer的表達下調（P

5、<0.01）；無轉移能力的肝癌細胞HepG2中SRC、FAK表達增高不明顯，（P>0.05），Dicer的表達下調（P<0.05）。高濃度 Calpain inhibitor IV和Calpastatin處理3種肝癌細胞和1種正常肝細胞72h后，與未加抑制劑組相比，具有轉移能力肝癌細胞的SRC、FAK的表達下調（P<0.01），無轉移能力的肝癌細胞HepG2中SRC、FAK表達下調不明顯（P>0.05），Dicer的表達上調（P<0.0

6、1）。(4)劃痕實驗結果顯示，高濃度ALLM和Calpain inhibitor VI處理3種肝癌細胞和1種正常肝細胞72h后，與0h相比，高轉移性肝癌細胞MHCC97-H的遷移能力減弱（P<0.05）；高濃度Calpain inhibitor IV和Calpastatin處理種肝癌細胞和1種正常肝細胞72h后，與0h相比，3種不同轉移能力的肝癌細胞（MHCC97-H、HepG2、MHCC97-L）遷移能力都減弱（P<0.01或P<0.

7、05）。(5)侵襲實驗結果顯示，高濃度ALLM和Calpain inhibitor VI處理3種肝癌細胞和1種正常肝細胞72h后，4種細胞的侵襲能力無統(tǒng)計學差異（P>0.05），而高濃度Calpain inhibitor IV和Calpastatin處理3種肝癌細胞和1種正常肝細胞72h后，3種肝癌細胞侵襲能力下降（P<0.01）。
　　結論: (1)Calpain-2在3種肝癌細胞中高表達及有轉移能力肝癌細胞中表達程度更高，提示