鈣激活中性蛋白酶2對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞Myc-nick形成的影響.pdf

1、目的：通過觀察鈣激活中性蛋白酶2（Calpain-2）及雌激素（E2）對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞中原癌基因C-myc及其小片段（Myc-nick）蛋白表達(dá)水平的影響，探討Calpain-2對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞Myc-nick的作用途徑。
　　方法：1、采用MCF-7乳腺癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图?xì)胞，給予不同細(xì)胞培養(yǎng)密度，給予不同濃度雌激素（E2）、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和胰島素(insulin)刺激后，蛋白免疫印跡法(Western blo

2、t)檢測(cè)Myc-nick的形成條件；2、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建Calpain-2基因沉默的MCF-7細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的MCF-7細(xì)胞，采用Western blot法檢測(cè)Calpain-2對(duì)Myc-nick形成和C-myc（T58）磷酸化的影響、E2對(duì)Calpain-2沉默的MCF-7細(xì)胞中 C-myc、Myc-nick和C-myc（T58）磷酸化水平的影響、G-1（G蛋白耦聯(lián)受體-30阻斷劑）和4-羥基他莫昔芬（雌激素受體阻斷劑）對(duì)E2上調(diào)

3、Myc-nick的形成和促進(jìn)C-myc（T58）磷酸化的影響。
　　結(jié)果：1、MCF-7細(xì)胞在高密度（種植細(xì)胞數(shù)為9×107個(gè)/皿和12×107/皿）培養(yǎng)時(shí)，C-myc剪切增強(qiáng)，Myc-nick形成增多（P＜0.01 v.s.低密度培養(yǎng)組）；E2（10-9~10-7g/mL）和胰島素（10~1000μg/mL）可促進(jìn)C-myc水解，使Myc-nick形成增多（P＜0.05 v.s. Control）； EGF(10-9~10-8m

4、ol/L)可抑制C-myc水解，使Myc-nick形成減少（P＜0.01 v.s.Control）；2、Calpain-2基因沉默的MCF-7細(xì)胞Myc-nick的形成被完全抑制，C-myc（T58）磷酸化也被顯著抑制（P＜0.01 v.s. Control）；E2刺激Calpain-2基因沉默的MCF-7細(xì)胞時(shí)，C-myc表達(dá)沒有變化，也不能逆轉(zhuǎn)Calpain-2基因沉默對(duì)C-myc水解的影響；在Calpain-2基因沉默條件下，E2

5、可以一定程度促進(jìn)MCF-7細(xì)胞C-myc（T58）磷酸化（P＜0.05 v.s. Control）；G-1明顯減弱了E2上調(diào)Myc-nick形成的作用（P＜0.05 v.s. Control），而4-羥基他莫昔芬對(duì)E2上調(diào)Myc-nick形成沒有明顯作用；G-1和4-羥基他莫昔芬對(duì)E2引起C-myc（T58）磷酸化的作用影響不大。
　　結(jié)論：MCF-7乳腺癌細(xì)胞中有明顯的C-myc表達(dá)，MCF-7細(xì)胞高密度時(shí)細(xì)胞中有Myc-nic