蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制劑聯(lián)合蛇毒金屬蛋白酶抑制劑抗肝癌細(xì)胞(MHCC97H)的侵襲轉(zhuǎn)移作用.pdf

1、原發(fā)性肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，病死率高，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的最主要因素。肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力與其產(chǎn)生降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的蛋白水解酶能力密切相關(guān)。目前針對ECM相關(guān)蛋白酶的生物治療已經(jīng)成為肝癌治療研究的熱點，其中蛇毒活性成分的藥用價值更是不斷得到認(rèn)可。我們前期克隆了蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制劑(sv-Cystatin)和蛇毒金屬蛋白酶抑制劑(BJ46a)基因，初步證明其各自具有抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16的侵襲轉(zhuǎn)移功能。鑒于s

2、v-Cystatin和BJ46a抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用的靶點不同，我們設(shè)想二者聯(lián)合表達(dá)存在協(xié)同作用的可能。為此，我們應(yīng)用雙基因真核表達(dá)載體將sv-Cystatin和BJ46a同時導(dǎo)入人的高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株MHCC97H，通過體外和動物在體實驗研究各自的抗肝癌侵襲轉(zhuǎn)移作用、協(xié)同作用和存在的新功能，探討兩種基因的表達(dá)對肝癌細(xì)胞影響的可能分子機制，并利用重組sv-Cystatin與BJ46a腺病毒觀察體內(nèi)應(yīng)用的初步治療效果。 一、表達(dá)sv

3、-Cystatin或/和BJ46a基因的MHCC97H細(xì)胞株的建立 利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了重組表真核達(dá)載體pBudCE4.1/sv-Cystatin、pBudCE4.1/BJ46a和pBudCE4.1/sv-Cystatin+Bj46a；經(jīng)Westem Blot證實建立的細(xì)胞株MHCC97H/sv-Cystatin、MHCC97H/BJ46a和MHCC97H/sv-Cystatin+Bj46a可以分別穩(wěn)定表達(dá)sv-Cystati

4、n、BJ46a和同時表達(dá)sv-Cystatin和BJ46a，為后續(xù)研究提供了實驗材料。 二、sv-Cystatin或/和BJ46a表達(dá)對MHCC97H細(xì)胞生長、侵襲轉(zhuǎn)移功能的影響 體外細(xì)胞活力和裸鼠皮下肝癌細(xì)胞原位瘤重分析表明，表達(dá)sv-Cystatin能顯著地抑制MHCC97H細(xì)胞的體外、體內(nèi)增殖能力，但sv-Cystatin和BJ46a共同表達(dá)時沒有協(xié)同作用。細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)表達(dá)sv-Cystatin可以使MHCC97

5、H細(xì)胞具有聚集成團(tuán)傾向，細(xì)胞間連接更為緊密，并具有抑制MHCC97H細(xì)胞體外趨化的作用。利用Transwell--Matrigel實驗和裸鼠皮下肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型證實表達(dá)sv-Cystatin和BJ46a具有各自抑制MHCC97H細(xì)胞體外、體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移的作用，共表達(dá)時具有協(xié)同作用。 三、sv-Cystatin或／和BJ46a表達(dá)對MHCC97H細(xì)胞生長、侵襲轉(zhuǎn)移影響的分子機制 流式細(xì)胞檢測、電鏡觀察和TUNEL實驗證實誘

6、導(dǎo)凋亡是表達(dá)sv-Cystatin的MHCC97H細(xì)胞生長增殖能力降低的原因，其可能的機制為sv-Cystatin的表達(dá)下調(diào)Twist表達(dá)，降低Twist所介導(dǎo)的抑制P53分子通路的保護(hù)細(xì)胞作用，直接導(dǎo)致促凋亡作用的P53表達(dá)升高及其靶分子Bax的上調(diào)，啟動凋亡線粒體通路級聯(lián)反應(yīng)。BJ46a不具有此功能，故sv-Cystatin和BJ46a共表達(dá)時沒有體現(xiàn)誘導(dǎo)凋亡的協(xié)同作用。 細(xì)胞培養(yǎng)上清通過熒光分光光度檢測Cathepsin

7、B、明膠酶譜分析MMPs，培養(yǎng)細(xì)胞通過凝膠遷移分析轉(zhuǎn)錄因子Twist活性及其相關(guān)的E-cadherin和N-cadherin表達(dá)等證明：(1) MMP2和MMP9的活性的下降是表達(dá)BJ46a的MHCC97H細(xì)胞侵襲能力減弱的直接原因；(2) CathepsinB、MMP2和MMP9活性的同時下降，Twist活性減弱導(dǎo)致的E-cadherin表達(dá)上調(diào)和N-cadherin表達(dá)下調(diào)共同促成了表達(dá)sv-Cystatin的MHCC97H細(xì)胞侵襲

8、能力的抑制；(3)以上二者因素的協(xié)同作用導(dǎo)致同時表達(dá)sv-Cystatin和BJ46a的MHCC97H細(xì)胞的侵襲能力最弱。 四、重組sv-Cystatin和BJ46a腺病毒治療轉(zhuǎn)移性肝癌的實驗研究 利用腺病毒載體pShuttle-IRES-hrGFP-1構(gòu)建了攜帶sv-Cystatin和BJ46a基因的重組腺病毒。通過裸鼠皮下肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型的瘤內(nèi)注射治療實驗證實Ad/sv-Cystatin可以降低MHCC97H細(xì)胞的