蛇毒金屬蛋白酶抑制劑BJ46a抗黑色素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用.pdf

1、BJ46a(46-kDa isoform a from B.jaraca)是來(lái)自美洲矛頭蝮(Bothrops jararaea)血清的一類金屬蛋白酶抑制劑，屬cystatin超家族的胎球蛋白(fetuin)家族成員。BJ46a能有效抑制蛇毒金屬蛋白酶(snake venom metalloproteinases，SVMPs)蛋白水解活性，作用位點(diǎn)在金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域。鑒于SVMPs與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotei

2、nases，MMPs)同屬M(fèi)etzincins(鋅依賴金屬蛋白酶)家族，因此BJ46a可能通過(guò)與MMPs結(jié)合，抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究應(yīng)用基因工程技術(shù)，體外合成BJ46a基因，以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組BJ46a蛋白，并利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)和體內(nèi)外腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，從蛋白和基因水平探討B(tài)J46a抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用。 一、BJ46a基因合成根據(jù)GenBank中查找的BJ46a基因序列(AF294836)，將其分為20個(gè)片段，通過(guò)

3、緩慢退火PCR法使之拼接為完整的BJ46a基因，經(jīng)SacI及XhoI雙酶切后定向克隆到載體pET-42a(+)中，PCR擴(kuò)增、酶切及測(cè)序鑒定；根據(jù)測(cè)序結(jié)果用定點(diǎn)突變法逐-改正錯(cuò)誤位點(diǎn)。最終獲得的pET-42a(+)/BJ46a質(zhì)粒，為后續(xù)蛋白和基因水平的研究提供了正確的目的基因。 二、BJ46a在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)及其抗黑色素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用在成功合成BJ46a基因的基礎(chǔ)上，將其插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBae HTC

4、的MCS中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α-T1，以LB/AP平板篩選陽(yáng)性重組子，PCR擴(kuò)增、酶切鑒定，提取pFastBae HT C-BJ46a重組體進(jìn)一步轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，48h后通過(guò)藍(lán)白篩選，挑取單個(gè)白色菌落劃線，證實(shí)所得菌落均為白斑，挑克隆PCR鑒定。結(jié)果表明成功構(gòu)建桿狀病毒重組轉(zhuǎn)座載體、重組穿梭載體。以Cellfectin脂質(zhì)體與重組桿狀病毒Bacmid-BJ46a混合，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲P1病毒株；小規(guī)模、低滴度P1病

5、毒株再感染昆蟲(chóng)細(xì)胞獲得更高滴度的P2病毒株，進(jìn)而擴(kuò)增P3病毒株；將較高滴度的重組桿狀病毒液感染Sf9，Western blot示重組BJ46a蛋白能有效表達(dá)，且最佳表達(dá)時(shí)間為感染后4d。經(jīng)ProBond親和層析純化出的重組BJ46a蛋白具有抑制MMPs的活性。利用Transwell小室分析重組BJ46a蛋白對(duì)小鼠B16細(xì)胞體外侵襲能力的影響，結(jié)果表明：重組BJ46a蛋白處理的B16細(xì)胞穿過(guò)Matrigel的細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.

6、01)，抑制率為84.8％。重組BJ46a蛋白處理的B16細(xì)胞經(jīng)尾靜脈接種C57BL/6小鼠，建立B16細(xì)胞實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型，20d后處死小鼠示其肺部轉(zhuǎn)移瘤灶較對(duì)照組明顯減少(P<0.001)。這些證明重組BJ46a蛋白能抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。 三、BJ46a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及其抗黑色素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用構(gòu)建BJ46a真核表達(dá)載體pcDNA3.1HisC-BJ46a，fugene 6法轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞，經(jīng)G418篩選抗性細(xì)胞克隆

7、，RT-PCR鑒定，alamarblue法檢測(cè)BJ46a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆株體外生長(zhǎng)和粘附能力的變化，Transwell小室和小鼠實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型分析BJ46對(duì)黑色素瘤細(xì)胞體內(nèi)、外侵襲力的影響。結(jié)果示B16/pcDNA3.1HisC-BJ46a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株體外侵襲能力明顯降低，其穿膜的細(xì)胞數(shù)顯著低于B16/pcDNA3.1HisC空載體組和空白對(duì)照B16細(xì)胞組(P<0.01)，抑制率為59.2％；其體外增殖、粘附、運(yùn)動(dòng)能力未見(jiàn)明顯改變。