金屬蛋白酶9及其siRNA與不同轉(zhuǎn)移潛能黑色素瘤細(xì)胞系生長及侵襲能力的相關(guān)性研究.pdf

1、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因，因此針對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究成為腫瘤治療的重要部分。基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）是降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的重要酶，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成密切相關(guān)，在多種腫瘤組織中有較高的表達(dá)。RNA干擾技術(shù)是近年來產(chǎn)生的新興生物技術(shù)，可特異性地導(dǎo)致相應(yīng)的mRNA降解，從而阻斷特定基因的表達(dá)。有望成為治療腫瘤的新手段。
　　 目的：研究3種不同轉(zhuǎn)移潛能的黑色素瘤細(xì)胞系中MMP9的表達(dá)及其與腫瘤生長、

2、侵襲能力的關(guān)系；并應(yīng)用RNA干擾技術(shù)降低MMP9的表達(dá)，觀察干預(yù)MMP9后對黑色素瘤細(xì)胞系生長，黏附和侵襲的影響。
　　 方法：本課題分兩部分進(jìn)行，第一部分western blot研究了3種不同轉(zhuǎn)移潛能的黑色素瘤細(xì)胞系（WM35，WM983a，WM451）的MMP9的表達(dá)情況，利用黏附實(shí)驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)檢測它們的體外黏附及侵襲能力。進(jìn)一步確定MMP9的表達(dá)與腫瘤侵襲的關(guān)系。第二部分在第一部分的基礎(chǔ)上選擇侵襲轉(zhuǎn)移能力最高的WM451細(xì)

3、胞系，利用載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)干預(yù)MMP9的表達(dá)，并測定干擾后對WM451細(xì)胞系生長、侵襲能力的變化。
　　 結(jié)果：Western blot顯示3種細(xì)胞系中WM451的MMP9的表達(dá)量最高。而細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示W(wǎng)M35，WM983a，WM451三種細(xì)胞系在24h內(nèi)的遷移距離分別為0.11±O.009mm，1.44±0.165mm和1.72±0.124mm，WM983a和WM451的遷移距離與WM35的相比有顯著性差異（Pwm3

4、5-wm983a=0.000，Pwm35-wm451=0.000<0.01），并且WM451的遷移距離最長，但與WM983a相比無顯著性差異（p=0.079>0.05）；細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)顯示W(wǎng)M35，WM983a和WM451在10min，30min，60min，120min時(shí)與Matrigel的黏附率分別為12.40％，30.50％和35.40％：38.67％，53.37％和60.62％；74.95％，80.20％和78.6％；82.65％

5、，82.30％和87.2％。可見細(xì)胞孵育10min后，WM35粘附于Matrigel的細(xì)胞數(shù)明顯少于WM983a和WM451，其粘附率為12.6％（Pwm35-wm983a=0.000，Pwm35-wm451=0.000<0.01），而WM983a和WM451粘附率分別為30.5％和35.5％，兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p=0.123>0.05）。在30min時(shí)的數(shù)據(jù)與10min時(shí)類似。但在60min，120min時(shí)三種細(xì)胞在Matrige

6、l上的粘附能力無差異；利用siRNA干擾WM451細(xì)胞MMP9的表達(dá)后，細(xì)胞的MMP9表達(dá)量較對照組（轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒）降低；CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞增殖能力降低，在48h時(shí)（P48h=0.004<0.01）和72h時(shí)（P72h=0.001<0.01），與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對照組比較，轉(zhuǎn)染siRNA組在24h，48h，和72h的抑制率分別為1.73±1.5％，12.18±4.1％和13.79±3.3％；細(xì)胞黏附能力及侵襲能力也表現(xiàn)

7、出明顯的下降，其中劃痕試驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的遷移距離為0.84±0.06mm，相對于陰性對照組的遷移距離1.50±0.386mm，兩者之間有差異（P=0.043<0.05）。
　　 結(jié)論：⑴MMP9在不同轉(zhuǎn)移潛能黑色素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)量由高到低為WM451>WM983a>WM35，而3種細(xì)胞系的體外侵襲能力由高到低為WM451>WM983a>WM35，說明了MMP9在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的重要作用。⑵應(yīng)用RNA干涉技術(shù)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染siRNA