lncRNA HOTAIR、MDA9蛋白及GRP78蛋白在惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的研究.pdf

1、惡性黑色素瘤是一種惡性程度極高的皮膚腫瘤,是皮膚病中死亡率最高的疾病。侵襲和轉(zhuǎn)移是影響該疾病患者生存的首要因素,也是其治療的最大障礙。關(guān)于惡性黑色素瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移的機制尚不十分清楚。因此,有必要對其侵襲和轉(zhuǎn)移機制進行研究,進而為臨床診斷、防治惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供分子水平的新型治療方法。
　　目的：
　　1、通過定量反轉(zhuǎn)錄PCR從6個長鏈非編碼RNA(lncRNA)中篩選出與惡性黑色素瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性最大的lncRNA,研

2、究它與惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系,以期為惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的治療提供靶目標;
　　2、通過雙向電泳實驗從3對原發(fā)黑色素瘤組織及對應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中篩選出與惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白,以期發(fā)現(xiàn)它們影響惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機制,為臨床診斷、防治惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供分子水平的新型治療方法。
　　方法：
　　1、從3對原發(fā)黑色素瘤組織及對應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中提取出總 RNA,再用總RNA通過反轉(zhuǎn)錄

3、PCR從6個長編碼RNA中選出與惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)性最大的lncRNA;
　　2、從3對原發(fā)黑色素瘤組織及對應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中提取出總的蛋白質(zhì),通過雙向電泳實驗篩選出與惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白,并從中挑選出在原發(fā)及轉(zhuǎn)移惡性黑色素瘤中表達差異明顯的并可能存在相互作用的兩種蛋白,再通過熒光定量PCR驗證雙向電泳實驗的結(jié)果;
　　3、通過分子克隆技術(shù)得到含編碼這兩種蛋白的基因的質(zhì)粒,并將克隆得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293

4、T細胞中通過western blotting檢測其蛋白的表達;
　　4、將篩選出的lncRNA及這兩種蛋白的siRNA轉(zhuǎn)染至A375細胞中,并通過PCR驗證siRNA的下調(diào)功能;
　　5、用轉(zhuǎn)染了篩選出的lncRNA及這兩種蛋白的siRNA及非靶目標 siRNA(siControl)的A375細胞通過基質(zhì)膠侵襲試驗及劃痕試驗驗證該lncRNA及蛋白對黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是否產(chǎn)生影響;
　　6、用轉(zhuǎn)染了該lncRNA的si

5、RNA及非靶目標siRNA(siControl)的A375細胞通過原位酶譜試驗驗證該lncRNA對惡性黑色素瘤細胞的白明膠酶活性是否產(chǎn)生影響;
　　7、通過CO-IP試驗驗證這兩種蛋白之間是否存在相互作用;
　　8、如果這兩種蛋白之間存在相互作用,通過相關(guān)軟件推測這兩種蛋白相互作用的可能機制,并通過相應(yīng)的試驗進行驗證這種作用機制對惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移起作用。
　　結(jié)果：
　　1、通過反轉(zhuǎn)錄PCR篩選出lncR

6、NA HOTAIR與惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān),并通過劃痕試驗、侵襲試驗以及原位酶譜試驗充分證實了lncRNA HOTAR能促進惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　2、通過雙向電泳實驗篩選出MDA9及GRP78這兩種蛋白與惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān),并通過劃痕試驗及侵襲試驗證實了MDA9及GRP78這兩種蛋白能促進惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,但這兩種蛋白是否存在相互作用以及它們促進惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機制有待進一步研究。
　

7、　討論：
　　1、本實驗證實了lncRNA HOTAR能促進惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,盡管需要進一步關(guān)于HOTAIR對腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的影響機制的研究,但在該研究中所觀察到的HOTAIR轉(zhuǎn)移活性說明HOTAIR可能是治療惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的潛在靶目標。
　　2、本實驗證實了MDA9及GRP78這兩種蛋白的表達能促進惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,但尚需進一步的研究證明這兩種蛋白是否存在相互作用以及它們促進惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的