基質(zhì)金屬蛋白酶及其相關(guān)抑制劑在異位骨化中作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　異位骨化(Heterotopic Ossification，HO)是指在正常情況下沒(méi)有骨組織的軟組織內(nèi)形成的新生病理骨組織，其既不是單純的鈣鹽沉積，也不同于骨折愈合中的新骨形成。隨著人工關(guān)節(jié)置換的廣泛應(yīng)用以及交通傷導(dǎo)致的高能量創(chuàng)傷數(shù)量增加，異位骨化發(fā)病率也顯著上升，研究表明在沒(méi)有進(jìn)行預(yù)防性治療的情況下，異位骨化發(fā)生率高達(dá)60％-75％，髖臼骨折切開(kāi)復(fù)位內(nèi)固定術(shù)發(fā)生率超過(guò)60％，脊髓損傷后的發(fā)生率為20％-25％，其

2、中約18％-35％出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，閉合性顱腦損傷后異位骨化的發(fā)生率為10％-20％，其中約10％產(chǎn)生明顯的關(guān)節(jié)活動(dòng)受限。HO的發(fā)病主要可分為三個(gè)階段:(1)炎性浸潤(rùn)及間充質(zhì)干細(xì)胞分化階段，(2)軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞等生長(zhǎng)階段，(3)病理骨組織成熟階段。早期HO局部有明顯腫痛，關(guān)節(jié)活動(dòng)受限。晚期由于骨組織形成，導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動(dòng)限制。其基本病理改變是在纖維結(jié)締組織中，原始細(xì)胞增殖活躍伴有豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)，鈣鹽沉積，形成骨。成熟的異位骨化具

3、有骨的結(jié)構(gòu)，外層包裹纖維結(jié)締組織，里面是成骨細(xì)胞，具有小梁結(jié)構(gòu)及類骨組織，中心是活躍的原始細(xì)胞。臨床診斷主要依靠X線及CT檢查進(jìn)行診斷。治療中往往對(duì)存在高危因素患者實(shí)行預(yù)防性治療如放射治療、非甾體類抗炎藥及二磷酸鹽等，然而傳統(tǒng)非甾體類抗炎藥具有胃腸副作用，給患者帶來(lái)了傷痛，限制了其應(yīng)用，同時(shí)預(yù)防性放療會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)癌癥幾率增加，并干擾正常成骨（如骨折愈合和假體植入后的骨長(zhǎng)入），并且治療后仍有較高的發(fā)生率。對(duì)于已經(jīng)形成的異位骨化，臨床上有

4、效的治療方法只有手術(shù)切除，因此，對(duì)異位骨化的早期診斷可以避免對(duì)不出現(xiàn)異位骨化的患者進(jìn)行過(guò)度的預(yù)防性治療。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)家族是一類高度保守的鋅離子和鈣離子依賴的基因多態(tài)性內(nèi)切蛋白水解酶家族，由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞等以無(wú)活性的酶原形式分泌到細(xì)胞外，經(jīng)過(guò)活化后在中性條件下發(fā)揮活性。它的表達(dá)受即早基因、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子的調(diào)

5、節(jié)，同時(shí)很多細(xì)胞因子可誘導(dǎo)MMPs的表達(dá)，如白介素-1、白介素-6、血小板衍化生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-B、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子-a等，起抑制作用的有干擾素B-1b。MMPs除在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)節(jié)外，其活性亦在酶原激活、酶活性的抑制等環(huán)節(jié)受到調(diào)控，不同MMPs之間可能也具有活化作用，MMPs的蛋白水解酶活性受非特異性和特異性抑制劑抑制，非特異性抑制劑包括a2-巨球蛋白、a1-抗胰蛋白酶、巴馬斯汀(batimas

6、tatBB-1101、BB-94)等。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)是一種糖化蛋白酶，參與內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和基質(zhì)角質(zhì)細(xì)胞核遷移等，在基質(zhì)降解、組織重塑、細(xì)胞遷移、血管生成、傷口愈合，骨生長(zhǎng)等病理生理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是軟骨基質(zhì)降解中最重要的酶之一，是早期的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重組的生物標(biāo)記物。MMP-9表達(dá)細(xì)胞存在于骨髓中，在骨骼肌缺氧環(huán)境下會(huì)使MMP-

7、9極大的增強(qiáng)，同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞增加毛細(xì)血管網(wǎng)的生長(zhǎng)，并伴隨有MMP-2和MMP-9的升高。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)可表達(dá)在成骨細(xì)胞及部分破骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)可對(duì)骨基質(zhì)進(jìn)行降解，并抑制骨質(zhì)吸收和促進(jìn)骨重建修復(fù)。成骨細(xì)胞中分泌MMP-2蛋白的變化過(guò)程可反映骨代謝的基本情況，如果血清中MMP-2蛋白水平升高，骨轉(zhuǎn)換的速度也隨之增快。
　　第一章

8、MMP-9在大鼠跟腱異位骨化模型中的動(dòng)態(tài)變化研究
　　目的：大鼠跟腱切斷HO模型是近年來(lái)運(yùn)用較多的HO模型，適用于創(chuàng)傷性HO的相關(guān)研究，基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase9，MMP-9)是一種糖化蛋白酶，由間質(zhì)細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，參與內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和基質(zhì)角質(zhì)細(xì)胞核遷移等，在基質(zhì)降解、組織重塑、細(xì)胞遷移、血管生成、傷口愈合，骨生長(zhǎng)等病理生理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵

9、作用。通過(guò)觀測(cè)創(chuàng)傷早期大鼠異位骨化模型中基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)變化，探討MMP-9對(duì)預(yù)測(cè)異位骨化發(fā)生的價(jià)值。
　　方法：取4-4.5周齡雄性SD大鼠132只，體重135.0±6.5g，隨機(jī)分為兩組(n=66)。實(shí)驗(yàn)組通過(guò)鉗夾并切斷跟腱制備異位骨化模型，對(duì)照組僅暴露跟腱。術(shù)后觀察兩組大鼠一般情況，2、3、4、5、6、7、8d兩組各取8只大鼠，取跟腱組織行大體、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色觀察，取血清及跟腱組織分別行ELISA及RT-PC

10、R檢測(cè)MMP-9蛋白含量及基因表達(dá)。通過(guò)兩組剩余10只大鼠術(shù)后5、10周X線片及術(shù)后10周組織學(xué)觀察結(jié)果，診斷異位骨化形成情況。
　　結(jié)果：所有大鼠均存活至實(shí)驗(yàn)完成。各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組大鼠跟腱無(wú)明顯變化，呈正常跟腱結(jié)構(gòu);實(shí)驗(yàn)組隨時(shí)間延長(zhǎng)，跟腱斷端硬度逐漸增加，出現(xiàn)大量不規(guī)則結(jié)締組織及軟骨細(xì)胞，MMP-9免疫組織化學(xué)染色呈深染陽(yáng)性。各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組MMP-9蛋白含量及基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組MMP-9蛋白含量

11、及基因相對(duì)表達(dá)量均總體呈上升趨勢(shì)(P＜0.05)。根據(jù)X線片及組織學(xué)觀察結(jié)果，術(shù)后10周實(shí)驗(yàn)組大鼠跟腱組織均發(fā)生異位骨化，對(duì)照組均無(wú)異位骨化發(fā)生。
　　結(jié)論：在大鼠跟腱異位骨化早期，MMP-9表達(dá)明顯升高，提示其對(duì)預(yù)測(cè)異位骨化發(fā)生有參考意義。
　　第二章 MMP-9，MMP-2，TIMP-1在創(chuàng)傷性異位骨化動(dòng)物模型中的動(dòng)態(tài)變化研究
　　目的：大鼠自由落體腦創(chuàng)傷模型是一種較為成熟的腦創(chuàng)傷模型，大鼠跟腱HO模型也是近年來(lái)運(yùn)

12、用較多的HO模型。我們運(yùn)用這2種模型互相疊加，通過(guò)對(duì)比是否合并腦創(chuàng)傷，探討腦創(chuàng)傷對(duì)異位骨化的影響。同時(shí)對(duì)異位骨化早期MMP-9，MMP-2以及TIMP-1的蛋白變化曲線進(jìn)行研究分析，探討MMP-9，MMP-2，TIMP-1在異位骨化早期的作用機(jī)制以及與異位骨化發(fā)生的關(guān)系。
　　方法：取4-4.5周齡雄性SD大鼠264只，體重135.0±6.5g，隨機(jī)分為四組(n=66)。分別為腦創(chuàng)傷合并跟腱鉗夾切斷組（A組），腦創(chuàng)傷合并創(chuàng)傷對(duì)照組

13、（B組），跟腱鉗夾切斷組（C組），創(chuàng)傷對(duì)照組（D組）。術(shù)后1、2、3、4、5、6、7天，分別從4組大鼠隨機(jī)取8只大鼠進(jìn)行解剖及標(biāo)本收集、分析。4組大鼠各留10只于術(shù)后5、10周觀測(cè)動(dòng)物模型的制備效果。取跟腱組織行大體、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色觀察，取血清及跟腱組織分別行ELISA及RT-PCR檢測(cè)MMP-9，MMP-2，TIMP-1蛋白含量及基因表達(dá)。通過(guò)兩組剩余10只大鼠術(shù)后5、10周X線片及術(shù)后10周組織學(xué)觀察結(jié)果，診斷異位骨化形成

14、情況。
　　結(jié)果：所有大鼠均存活至實(shí)驗(yàn)完成。A組與B組大鼠出現(xiàn)行動(dòng)遲緩，進(jìn)食減少，體重下降等癥狀。四組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)右下肢活動(dòng)減少，2-3周后恢復(fù)正常。A組大鼠術(shù)后5周X線片觀察，出現(xiàn)高亮陰影100％(10/10)，術(shù)后10周出現(xiàn)高亮陰影100％(10/10)。B組大鼠術(shù)后5周，出現(xiàn)高亮陰影40％(4/10)，術(shù)后10周出現(xiàn)高亮陰影80％(8/10)。C組大鼠術(shù)后5周X線片觀察，出現(xiàn)高亮陰影80％(8/10)，術(shù)后10周出現(xiàn)高亮陰

15、影100％(10/10)。D組大鼠術(shù)后5周X線片觀察，出現(xiàn)高亮陰影0％(0/10)，術(shù)后10周出現(xiàn)高亮陰影0％(0/10)。四組動(dòng)物模型血清MMP-9，MMP-2，TIMP-1蛋白含量及其基因相對(duì)表達(dá)量均出現(xiàn)升高(P＜0.05)。A，B，C組大鼠血清MMP-9蛋白含量均高于D組大鼠(P＜0.05)，A組與C組大鼠術(shù)后5-7天MMP-9蛋白含量均高于B組大鼠(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)中A、B、C組大鼠MMP-2基因表達(dá)量均高于D組(P＜0.0

16、5)。A、B、C組大鼠TIMP-1蛋白均較D組大鼠升高(P＜0.05)。A、C兩組進(jìn)行跟腱鉗夾的大鼠，TIMP-1基因相對(duì)表達(dá)量明顯較B、D兩組升高(P＜0.05)。從術(shù)后5天起，各組大鼠MMP-9敏感曲線面積達(dá)到1.0(P=0.001)，D組大鼠MMP-9蛋白與TIMP-1蛋白呈正相關(guān)(P＜0.05)，A、B、C組大鼠均不具有相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)論：1.腦創(chuàng)傷會(huì)導(dǎo)致大鼠MMP-9與MMP-2在術(shù)后早期出現(xiàn)升高;2.腦創(chuàng)傷能使未達(dá)到

17、異位骨化發(fā)生程度的創(chuàng)傷部位發(fā)生異位骨化的病理變化，提高異位骨化的發(fā)病率及異位骨化的嚴(yán)重程度;3.MMP-9，MMP-2，TIMP-1這三種蛋白在異位骨化發(fā)病過(guò)程及創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中均起重要作用;4.血清中MMP-9蛋白含量可能與異位骨化的嚴(yán)重程度呈正比，且具有早期預(yù)測(cè)異位骨化發(fā)生的意義;5.血清中MMP-9蛋白含量在術(shù)后5-7天診斷異位骨化的敏感性最高;6.TIMP-1蛋白主要與局部組織損傷程度相關(guān)，在局部組織主要起保護(hù)作用;7.異位骨化的