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1、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(neutralprotease),是一類(lèi)被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的酶類(lèi),在洗滌劑、制革、絲綢、食品加工等多種行業(yè)上有著廣泛的用途。本課題主要是通過(guò)體外定向分子進(jìn)化技術(shù),改造nprE基因,從而構(gòu)建能夠高效穩(wěn)定生產(chǎn)中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株。主要結(jié)果如下: 1.運(yùn)用PCR技術(shù),從枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)株擴(kuò)增出強(qiáng)啟動(dòng)子P43序列和nprE全長(zhǎng)基因??寺〉絧MD18-T載體中,鑒定了上述基因。標(biāo)準(zhǔn)株nprE序列與已公布序
2、列完全相同。 2.鑒定了產(chǎn)蛋白酶效率較高的11株分離株,PCR擴(kuò)增得到其中8株的nprE全長(zhǎng)基因。 3.構(gòu)建枯草芽孢桿菌原核表達(dá)載體pNP43-nprE,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168菌株,并在枯草芽孢桿菌中表達(dá),12%SDS。PAGE電泳分析,重組菌可表達(dá)分子量分別約為42kDa的蛋白。經(jīng)抗生素壓力選擇后,表達(dá)量在OD600為0.8時(shí),酶產(chǎn)量出現(xiàn)最高,粗酶液酶活力達(dá)到了出發(fā)菌株的3倍。 3.以nprE全長(zhǎng)基因?yàn)?/p>
3、出發(fā)點(diǎn),應(yīng)用基因家族改組(FamillyDNAShuffling)技術(shù),以標(biāo)準(zhǔn)株和野生型菌株的nprE基因作為材料,對(duì)其進(jìn)行突變。在酶產(chǎn)率未提高的情況下,第一輪篩選,突變株酶活力提高了126%,以第一輪篩選的高活力突變株為基礎(chǔ)進(jìn)行第二輪突變和篩選,酶活力又提高了將近90%,且能夠穩(wěn)定遺傳。分析表明,nprE基因的堿基發(fā)生了改變。這種改變引起了其產(chǎn)物中性蛋白酶分子的氨基酸的改變,從而造成酶活力的改變。 通過(guò)比較,發(fā)現(xiàn)應(yīng)用表達(dá)載體在
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