12632.定向進化技術(shù)提高枯草芽孢桿菌角蛋白酶活性研究

1、SichuanAgriculturalUniversityDISSERTATIONSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementforMASTERDEGREEThereserchofimprovingactivityofKeratinaseGenefromBacillussubtilisbydirectedevolutionByGaoJingleiDirectedbyProfChenHUiJu

2、ne2014中文摘要角蛋白酶(keratinase)可以由很多種微生物分泌產(chǎn)生，是一類對角蛋白具有一定特異降解能力的酶類。由于角蛋白降解后含有很多的氨基酸及微量元素，生長因子，通過利用角蛋白酶降解作用，可以把廢棄的羽毛中的角蛋白制作成動物飼料的添加劑，從而為動物飼喂添加更多的營養(yǎng)物質(zhì)，而且角蛋白酶的降解反應(yīng)條件比較溫和，不會產(chǎn)生污染環(huán)境的問題。通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)對角蛋白酶基因進行改造是獲得更高科學和實用價值的角蛋白酶的有效途徑。本研究采

3、用定向進化技術(shù)來對角蛋白酶基因進行改造，其中易錯PCR技術(shù)是本實驗室比較成熟的一種手段。經(jīng)過前期的易錯條件的摸索，在體系加入錳離子，增加鎂離子的濃度，并調(diào)整dNTP比例，隨機引入堿基突變構(gòu)建出基因多樣性突變體庫。通過96孔板結(jié)合酶標儀的方法進行高通量定向的篩選，得到酶活明顯提高的有益突變株GS，測定其酶活力可以達到30U抽L，比出發(fā)菌株DS(20U／mL)提高了50％：比活力為9543U／mg，較出發(fā)菌株DS(5917U／mg)提高了6

4、1％。該酶的最適反應(yīng)溫度為60“C，最適反應(yīng)pH為75。突變的角蛋白酶基因通過序列測定，分析發(fā)現(xiàn)得到的突變菌株GS角蛋白酶基因lO個堿基發(fā)生了突變，進而導致了4個氨基酸的變化，分別是126位組氨酸(His)突變?yōu)樘於彼?Asp)，165位半胱氨酸(Cys)突變?yōu)楦拾彼?Gly)，215位蘇氨酸(Thr)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)，300位甘氨酸(Gly)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)。通過生物學軟件分析發(fā)現(xiàn)突變株GS表達的角蛋白酶二級結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生

5、改變，理化性質(zhì)和等電點都和原始菌株的相似。利用三級結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn)多肽骨架、三維結(jié)構(gòu)以及活性中心等關(guān)鍵部位都與原始菌株一致。可以推測角蛋白酶酶的蛋白結(jié)構(gòu)由于突變菌株中幾個氨基酸的改變，輕微影響了一些次級鍵的形成以及電子云的分布，使得酶的蛋白結(jié)構(gòu)的柔性有一定程度的增加，最終提高了角蛋白酶的活力。通過以上研究，獲得了角蛋白酶活力提高的并且能夠在畢赤酵母中高效表達的角蛋白酶工程菌。通過對其二級結(jié)構(gòu)，三級結(jié)構(gòu)的預測以及酶學性質(zhì)的分析，為以后進一步定