地衣芽孢桿菌降解羽毛角蛋白及其發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的研究.pdf

1、畜禽類羽毛蘊(yùn)含了大量潛在的有用蛋白質(zhì)和氨基酸，我國羽毛角蛋白資源豐富，若合理利用可作為優(yōu)質(zhì)飼料蛋白。但是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定，極難降解，找到合適的方法是研究降解角蛋白的關(guān)鍵。傳統(tǒng)物理、化學(xué)降解法存在眾多缺陷，諸如效率低、耗能高、污染大，而采用微生物降解法效果顯著，既利用了蛋白資源，也有利于環(huán)環(huán)境保護(hù)。同時(shí)角蛋白及角蛋白酶的應(yīng)用還體現(xiàn)在各行各業(yè)中，有廣闊的前景及較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會價(jià)值。 本課題主要針對羽毛蛋白的資源化利用，從菌種的確定

2、入手，對微生物降解羽毛發(fā)酵技術(shù)和發(fā)酵工藝，以及所產(chǎn)的酶等進(jìn)行系統(tǒng)研究，并建立發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，取得的主要研究結(jié)果如下： 1.對兩株都能以羽毛為唯一碳源、氮源生長的高效降解菌進(jìn)行比較篩選，試驗(yàn)結(jié)果表明地衣芽孢桿菌ZJUQH(Bacillus licheniformis ZJUQH)能力最強(qiáng)。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入羽毛，250ml搖瓶發(fā)酵，4d～5d后羽毛完全脫落被分解。采用掃描電鏡拍攝結(jié)果顯示發(fā)酵5d中整片羽毛的降解情況。 2.

3、用地衣芽孢桿菌細(xì)胞直接降解羽毛，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對幾個(gè)主要影響條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：在細(xì)胞生長溫度40℃，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，發(fā)酵時(shí)間48h，裝液量為25ml，反應(yīng)pH值為7.5，菌體細(xì)胞加量為0.5g時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)酶結(jié)果最佳。而當(dāng)反應(yīng)pH值為7.0的時(shí)候，羽毛降解率結(jié)果最佳。前者很好的體現(xiàn)了正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)化作用。并且經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，酶活可達(dá)55.7U，略高于優(yōu)化前最大值。 3.進(jìn)行各培養(yǎng)條件優(yōu)化研究。羽毛發(fā)酵前經(jīng)0.1％的氫

4、氧化鈣處理3h，能極大提高羽毛粉消化率，并對以后的微生物產(chǎn)酶及羽毛降解起到明顯促進(jìn)效果。外加碳源中低濃度葡萄糖有利于羽毛分解和角蛋白酶合成，外加氮源沒有明顯作用。生長因子中玉米粉提取物對菌的生長和羽毛分解有很好促進(jìn)效果。金屬離子中鈣離子、鎂離子和表面活性劑中吐溫-80具有促進(jìn)效果，但作用不大。采用響應(yīng)面試驗(yàn)(BBD)設(shè)計(jì)對培養(yǎng)的營養(yǎng)組成和培養(yǎng)條件(葡萄糖、玉米提取物、磷酸氫二鉀)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果在最優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基：堿處理羽毛粉(雞毛粉)2

5、％，葡萄糖1.45％，玉米粉提取物0.735％，磷酸氫二鉀0.195％，初始pH 7.5，和最佳發(fā)酵環(huán)境條件下，37℃，180r/min，培養(yǎng)72h，產(chǎn)生的角蛋白酶活力最高達(dá)到85.8U，可溶性蛋白在96h最高可達(dá)1.13mg/ml。5d后羽毛粉降解率達(dá)84.06％。 4.在5-L自控式發(fā)酵罐中，采用最優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分批發(fā)酵條件為：攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，通氣量1L/min，培養(yǎng)溫度37℃，裝液系數(shù)0.6，pH值不控制，

6、接種量5％，發(fā)酵7d結(jié)果表明放大實(shí)驗(yàn)酶活最高值達(dá)到61U(72h)，最終的降解率達(dá)到64.1％(168h)，可溶性蛋白含量最高可達(dá)0.8874mg/ml(108h)，均不如搖瓶，但研究結(jié)果為以后的放大深入試驗(yàn)提供基礎(chǔ)。 5．建立微生物降解動(dòng)力學(xué)模型，地衣芽孢桿菌ZJUQH發(fā)酵產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)X=46.4356/1+e<'(3.8026-0.111125t)>和地衣芽孢桿菌zJuQH發(fā)酵羽毛降解動(dòng)力學(xué)X()=(1131253.4475-

7、8329.8338t)<'0.329965>，并對各自模型的參數(shù)進(jìn)行估計(jì)，對模型作了分析和評價(jià)。 6．對5-L發(fā)酵液的氨基酸進(jìn)行了分析，由發(fā)酵前后的對比可知羽毛粉經(jīng)發(fā)酵，原本在生羽毛粉中含量很低的必須氨基酸如：蛋氨酸、組氨酸和賴氨酸等都出現(xiàn)大幅度增加。同時(shí)羽毛經(jīng)過水解，提高消化率，其他各營養(yǎng)成分也得到了改善。因此認(rèn)為地衣芽孢桿菌ZJUQH發(fā)酵降解羽毛生產(chǎn)高營養(yǎng)價(jià)值的氨基酸是可行的，并可以進(jìn)一步優(yōu)化條件，擴(kuò)大試驗(yàn)規(guī)模。 7