角蛋白酶生產(chǎn)菌株選育、發(fā)酵與分離純化研究.pdf

1、本文分離到了一株產(chǎn)角蛋白酶的枯草芽孢桿菌，誘變育種得到了具有良好羽毛降解能力和較高產(chǎn)酶活力的菌株．KD-N<,2>；分別以羽毛和人發(fā)為底物對(duì)KD-N<,2>的產(chǎn)酶培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，探討了以羽毛為底物發(fā)酵所得角蛋白酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)，研究了角蛋白的降解過(guò)程及機(jī)理，最后對(duì)角蛋白酶脫毛效果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。主要研究結(jié)果如下： (1)從養(yǎng)殖場(chǎng)采集的樣品中分離到一株具有羽毛降解能力的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子特征鑒

2、定為枯草芽孢桿菌。通過(guò)亞硝基胍誘變得到一株酶活性提高1.5倍的突變株KD-N<,2>，該突變株最適生長(zhǎng)溫度和pH值分別為28℃和6.6，其發(fā)酵所得粗酶液的最適作用溫度為50℃，pH值為8.0。確定了以可溶性角蛋白和天青角蛋白作為底物的酶活性測(cè)定方法。 (2)比較了羽毛、蠶絲、羊毛、人發(fā)等底物誘導(dǎo)產(chǎn)角蛋白酶的效果，發(fā)酵24h時(shí)最佳底物為10 g/t，羽毛。初始pH值7.5-8.0，培養(yǎng)溫度23℃，接種量為2％-5％，種齡16h時(shí)有

3、利于產(chǎn)酶。正交實(shí)驗(yàn)確定了以羽毛為唯一底物時(shí)的培養(yǎng)基組成(g/L)：羽毛10，NaCl 0/5，MgSO<,4> 0.2，KH<,2>PO<,4>/K<,2>HPO<,4> 0.35/0.7，培養(yǎng)24h后酶活為66.5 U/mL。培養(yǎng)30h時(shí)角蛋白酶活性和可溶性蛋白含量達(dá)最大值，發(fā)酵液中含蘇氨酸，纈氨酸，蛋氨酸，異亮氨酸，苯丙氨酸和賴氨酸等必需氨基酸，半胱氨酸含量最高為0.154 mg/mL，氨含量為0.4424mg/mL。進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

4、結(jié)果表明，最佳產(chǎn)酶有機(jī)氮源牛肉膏濃度為0.5 g/L，有機(jī)碳源玉米粉為2 g/L，經(jīng)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化后培養(yǎng)基組成為(g/L)：NaCl 0.5，MgSO<,4> 0.2，KH<,2>PO<,4>/K<,2>HPO<,4> 0.35/0.7，CaCl<,2>0.01，牛肉膏0.5，玉米粉2.0。碳、氮源的同時(shí)加入不利于誘導(dǎo)性角蛋白酶的較快產(chǎn)生。 (3)以人發(fā)為底物發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：16 g/L人發(fā)濃度、初始pH值6．5

5、、裝液量20ml，接種量8％-10％時(shí)有利于產(chǎn)酶；在底物濃度10 g/L，接種量5％、培養(yǎng)溫度28。C、轉(zhuǎn)速200rpm時(shí)，最高產(chǎn)酶時(shí)間為36h：蔗糖、玉米粉、酵母提取物最佳產(chǎn)酶濃度均為10 g/L。部分因子實(shí)驗(yàn)表明。MgSO<,4>和K<,2>HPO<,4>對(duì)產(chǎn)角蛋白酶具有顯著影響，中心組合試驗(yàn)所得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)：MgSO<,4>0.832，K<,2>HPO<,4>2.38，NaCl 1.0，CaCl<,2>0.05，

6、KH<,2>PO<,4>0.4，蔗糖3，優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵后酶活性為124.8U/ml，較原培養(yǎng)基提高了83％。 (4)以5L發(fā)酵罐探討了以羽毛和人發(fā)為底物發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的動(dòng)力學(xué)。結(jié)果表明，以兩底物發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液pH值、可溶性氨基酸和蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。其中，以羽毛為底物的發(fā)酵過(guò)程中氨基酸的生成可以用Peal-Reed模型進(jìn)行描述：以羽毛為底物的菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型分別為： 以人發(fā)為底物發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)和

7、產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型分別為： (5)以40％-80％飽和硫酸銨對(duì)角蛋白酶進(jìn)行了回收，透析并濃縮后以凝膠層析和離子交換層析兩方法對(duì)角蛋白酶進(jìn)行了分離純化，以SDS-PAGE和毛細(xì)管電泳的方法檢驗(yàn)了角蛋白酶的純度。該角蛋白酶分子量為30.5 kDa，最適作用pH值和溫度分別為8.5和55℃，最適緩沖液為0.5mMTris-HCl；角蛋白酶活性被絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF部分抑制，EDTA在2.5mM、5mM和10mM三種濃度下均對(duì)角

8、蛋白酶活性具有激活作用；金屬離子Cu<'2+>，Mn<'2+>完全抑制角蛋白酶的活性，Ca<'2+>，Mg<'2+>，Zn<'2+>，Al<'3+>等離子和甲醇、乙醇、二甲基亞砜、異丙醇等有機(jī)溶劑部分抑制角蛋白酶的活性，去污劑SDS對(duì)角蛋白酶活性具有激活作用；角蛋白酶對(duì)可溶性蛋白質(zhì)酪蛋白、牛血清蛋白和卵白蛋白具有水解作用，對(duì)不溶性蛋白質(zhì)底物羽毛粉、人發(fā)和羊毛也具有一定的降解作用，對(duì)牛毛和蠶絲沒(méi)有作用；還原劑二硫蘇糖醇、巰基乙醇、亞硫酸鈉

9、和含硫化合物L(fēng)-半胱氨酸、DMSO、氨基磺酸銨對(duì)角蛋白酶分解羽毛粉具有促進(jìn)作用，以5mM DTT和5％的巰基乙醇對(duì)角蛋白酶激活作用最大，氨基磺酸銨對(duì)角蛋白酶的激活作用為首次報(bào)道。 (6)發(fā)酵過(guò)程中羽毛的降解率隨羽毛含量增加而減小，在10 g/L羽毛含量時(shí)，初始pH值8.0-8.5，培養(yǎng)溫度為32℃，接種量2％，種齡20h降解率較高。以羽毛、人發(fā)和蠶絲為底物發(fā)酵過(guò)程中，三種底物均有不同程度的降解，推測(cè)為發(fā)酵液對(duì)底物的溶脹作用、菌體