高產(chǎn)纖維素酶菌株選育、分子鑒定及發(fā)酵工藝研究.pdf

1、纖維素酶在一切以植物為原料的加工業(yè)中，如釀造、果汁與蔬菜汁加工、糧食加工、食品、飼料、造紙、中草藥有效成分提取、植物基因工程和細(xì)胞工程以及原油開(kāi)采、紡織工業(yè)、廢水處理、生物能源生產(chǎn)等各個(gè)方面，均有很大的應(yīng)用價(jià)值。目前關(guān)于纖維素酶方面的研究很多，主要瓶頸性的問(wèn)題在于目前用于纖維素酶的生產(chǎn)菌如里氏木酶，青霉等，酶活力都比較低，纖維素酶用量大，成本高。高產(chǎn)纖維素酶的菌株，較優(yōu)的發(fā)酵工藝條件以及適宜的酶反應(yīng)體系條件，都能提高纖維素酶活，有效的降

2、低纖維素酶的成本。
　　 本文從岳麓山枯枝腐木土壤下采樣，利用剛果紅培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)良產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選，通過(guò)不同物理方法對(duì)其進(jìn)行誘變選育，并通過(guò)顯微鏡和16s rDNA對(duì)突變株進(jìn)行綜合的分子鑒定，并對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化條件進(jìn)行了考察，同時(shí)對(duì)纖維素酶的反應(yīng)體系條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步的研究，主要結(jié)果如下：
　　 1.從自然界枯枝腐木土壤層下取樣，篩選出較高產(chǎn)纖維素酶的菌株A24，其CMCase酶活為20.37U/mL與FP

3、Aase酶活為1.20U/mL。
　　 2.對(duì)出發(fā)菌株A24，進(jìn)行紫外誘變，最佳時(shí)間為7min。在此條件下篩選獲得了一株遺傳穩(wěn)定性好而且CMCase酶活為25.35U/mL，F(xiàn)PAase酶活為1.33U/mL的突變株UV-37。對(duì)UV-37進(jìn)行60Co-γ射線誘變，最適誘變劑量為0.6KGy。在此條件下獲得一株遺傳穩(wěn)定性好而且纖維素酶活分別比野生菌提高了137.16％與118.80％的突變株Co-07。
　　 3.通過(guò)對(duì)

4、菌株的菌落、菌絲、以及孢子絲的形態(tài)進(jìn)行顯微鏡觀察，可以看出輻射狀的菌落，有較細(xì)的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲以及螺旋狀的孢子絲，從鏡檢形態(tài)上基本可以確定為鏈霉菌屬。對(duì)菌株的16s rDNA進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，利用。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，經(jīng)MEGA5.0軟件構(gòu)件系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)后可以確定為鏈霉菌屬中的三澤鏈霉菌亞種。
　　 4.通過(guò)產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，最終得到的最優(yōu)外部產(chǎn)酶培養(yǎng)條件為：50mL裝液量，175r/min轉(zhuǎn)速，

5、40℃，發(fā)酵120h，CMC酶活可達(dá)到74.06U/mL。依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得出最佳碳源為稻草粉，濃度為2.5％，氮源對(duì)本菌株產(chǎn)酶的影響不大，而磷酸鹽的最佳濃度為4％。由裝液量、稻草粉、磷酸鹽(KH2PO4)為主要影響因素的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最終的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果為表明3個(gè)因素對(duì)產(chǎn)酶都有極顯著的影響。通過(guò)SAS9.1軟件所建立的優(yōu)化模型，其R2=99.80％，能較好的模擬實(shí)際實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面優(yōu)化后的最終條件為：裝液量(X1)=60mL，稻草粉(X2

6、)=2.8％，KH2PO4(X3)=4.2％，CMC酶活為94.16U/mL。
　　 5.通過(guò)對(duì)本菌中CMC酶反應(yīng)體系的研究，初步得出最佳的酶促反應(yīng)體系：經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的酶液，在pH6.0的環(huán)境下，底物濃度為1.0％的體系中，于50℃水浴中，酶促反應(yīng)30min后，加入3.0mLDNS，煮沸10min。通過(guò)對(duì)纖維素酶相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的研究，CMC酶活在40℃與50℃的條件下，熱穩(wěn)定很好，70℃時(shí)，熱穩(wěn)定較差。CMC酶活在pH值6.0時(shí)，