BLYS-1芽孢桿菌np-1蛋白酶基因的高效表達及其酶性質(zhì)研究.pdf

1、　　本實驗所用的產(chǎn)NP蛋白酶的芽孢桿菌BLYS-1是本課題組2008年于宜昌土壤中分離并保存。經(jīng)過初步研究發(fā)現(xiàn)NP蛋白酶在適宜的水解條件下能夠?qū)⒋蠖沟鞍讖氐姿獬尚》肿与?并且水解產(chǎn)物無苦味,具有很好的開發(fā)潛力。為提高NP蛋白酶的表達量,設(shè)計使用強啟動子cry3A與pHT304質(zhì)粒構(gòu)建表達載體,轉(zhuǎn)化蘇云金芽孢桿菌無質(zhì)粒突變株BMB171得到兩株重組蘇云金芽孢桿菌。通過發(fā)酵產(chǎn)酶實驗對cry3A啟動子不同長度片段啟動蛋白酶表達的能力進行了研

2、究,實驗結(jié)果表明pro3Ab啟動蛋白酶表達的能力明顯高于 pro3Aa。對這兩株重組菌進行了高表達,易純化,高產(chǎn)酶活性研究,并對NP蛋白酶的特性進行了初步研究。主要包括以下研究內(nèi)容：
　　以 BLYS-1 芽孢桿菌為出發(fā)菌,通過 DPS 軟件進行均勻?qū)嶒炘O(shè)計,綜合各因素對BLYS-1芽孢桿菌產(chǎn)酶的影響,探索出最適宜的產(chǎn)酶條件組合。通過稀鹽酸沉淀法分離純化了NP蛋白酶,并確定NP蛋白酶的最適水解條件為pH8.0、溫度60℃和酶活

3、持續(xù)時間4h。以豆?jié){為低物對NP蛋白酶的水解性能進行了研究,在50℃ 水解4h能夠?qū)⒍節(jié){中 30-100 KDa 的大分子蛋白徹底水解成 2-4 KDa 的小分子多肽。通過Native-PAGE和SDS-PAGE對NP蛋白酶的結(jié)構(gòu)組成進行了研究,活性蛋白的分子量為110 KDa,共有3個35 KDa的蛋白單體組成。
　　以 BLYS-1 芽孢桿菌總 DNA 為模板,通過一對引物成功克隆了 np-1 基因；以T6芽孢桿菌總DNA

4、為模板,通過兩對引物成功克隆了cry3A基因的啟動子pro3Aa和pro3Ab。將pro3Aa和pro3Ab與np-1基因組成融合基因并連接pHT304質(zhì)粒,構(gòu)建重組質(zhì)粒 pBLYS-3Aa-np 和 pBLYS-3Ab-np。以重組質(zhì)粒 pBLYS-3Aa-np 和pBLYS-3Ab-np 電擊轉(zhuǎn)化 BMB171 ,成功篩選出兩個轉(zhuǎn)化子 BLYS-3Aa-np 和BLYS-3Ab-np,對這兩個轉(zhuǎn)化子進行產(chǎn)酶實驗,證明兩株重組菌可成功

5、表達蛋白酶。
　　對重組菌BLYS-3Aa-np和BLYS-3Ab-np進行發(fā)酵產(chǎn)酶試驗,通過Native-PAGE結(jié)合干酪素平板對產(chǎn)酶條件進行了探索。Native-PAGE測定重組菌發(fā)酵液中蛋白酶分子量為110 KDa,SDS-PAGE測定重組菌蛋白酶亞基為35 KDa,與BLYS-1發(fā)酵液測定結(jié)果一致,說明重組菌成功表達了NP蛋白酶。重組菌BLYS-3Ab-np表達110 KDa蛋白酶的活性高于BLYS-3Aa-np和BL

6、YS-1,說明pro3Ab啟動子具有強的啟動轉(zhuǎn)錄的能力,構(gòu)建的高表達菌株成功。
　　對發(fā)酵液用 Folin-酚法測酶活,測得的結(jié)果為 BLYS-3Aa-np ( 65U )