嗜堿芽胞桿菌堿性蛋白酶的高效表達及應用.pdf

1、由于堿性蛋白酶具有催化反應速度快，無工業(yè)污染，適應性寬等優(yōu)點，被廣泛地應用于醫(yī)藥、食品加工、化妝品、洗滌劑、絲紡、毛皮軟化等行業(yè)。同時，經堿性蛋白酶水解、分離而來的酪蛋白磷酸肽，在食品、醫(yī)藥等行業(yè)也扮演著十分重要的作用。所以，為提高堿性蛋白酶的發(fā)酵活力，研究其在制備酪蛋白磷酸肽中的應用性能，本研究開展了以下工作:
　　利用PCR技術獲得了嗜堿芽胞桿菌B.licheniformis TCCC11006的堿性蛋白酶基因（apr），并將

2、該基因與表達載體pHY-WZX相連接，構建重組表達質粒pHY-WZX-apr。以蛋白酶基因缺失的B.licheniformis H115作為宿主菌，成功構建了一株堿性蛋白酶基因工程菌。經SDS-PAGE檢測，重組酶的分子質量為35 kDa左右。在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)56 h后，重組酶的最大酶活達到4910 U/mL，是出發(fā)菌株的2.79倍。將重組堿性蛋白酶進行初步純化后，與市售的1398中性蛋白酶和2709堿性蛋白酶的酶學性質進行比較后

3、，發(fā)現(xiàn)在較高的溫度和pH環(huán)境下，重組堿性蛋白酶的穩(wěn)定性較好;另外，Mn2+, Mg2+和Ca2+對其都有激活作用，只有少量的金屬離子對其有抑制作用。
　　通過正交實驗確定了工程菌最佳產酶培養(yǎng)基組成為乳糖50 g/L，豆餅粉40 g/L，氯化銨3 g/L，磷酸鹽15 mmol/L，氯化鈣0.2 g/L;通過單因素實驗確定搖瓶培養(yǎng)條件最佳組合為:種齡16h，接種量為4％，34℃發(fā)酵培養(yǎng)56h，發(fā)酵酶活達到6963 U/mL，是優(yōu)化前的