嗜酸乳桿菌JQ-1胞壁蛋白酶的分離純化及其水解酪蛋白產ACE抑制肽的研究.pdf

1、研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌發(fā)酵酪蛋白所制備的水解產物具有降血壓的功能，主要是由于乳桿菌的蛋白水解系統(tǒng)能分解酪蛋白產生活性多肽，這些多肽大都具有抑制血管緊張素轉移酶(Angiotensin I-Converting Enzyme，ACE)作用，從而達到降血壓等效果。本文就嗜酸乳桿菌JQ-1產胞壁蛋白酶的培養(yǎng)及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，并進行分離純化，水解酪蛋白條件優(yōu)化，及其水解對于酪蛋白結構及功能特性的影響進行了研究。
　　通過正交試驗確定了嗜酸

2、乳桿菌JQ-1產胞壁蛋白酶的最優(yōu)培養(yǎng)條件：含2％葡萄糖和1%牛肉蛋白胨的MRS改良培養(yǎng)基。通過單因素試驗和響應面分析法確定了嗜酸乳桿菌產胞壁蛋白酶的最佳發(fā)酵條件：初始pH值8.0、發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時間20h。驗證試驗結果表明響應面分析法對優(yōu)化產酶條件是可行的。
　　采用溶菌酶結合非離子表面活性劑法對胞壁蛋白酶進行提取，得出其最佳提取條件為：菌粉與裂解液比例為1：5，33℃下保溫4.0h，離心取得的上清液即為粗酶液。通過聚乙二醇

3、-20000濃縮，DEAE-Sephadex A-25和Sephadex G-100兩步層析對粗酶液進行分離純化，蛋白酶提純倍數(shù)達到50.951倍，最后回收率為12.569%，且SDS-PAGE檢測蛋白酶為單體結構，分子量為45kD。用純化后CEP水解β-酪蛋白，水解液ACE抑制率為48%。
　　采用單因素試驗和響應面中心組合設計確定了嗜酸乳桿菌JQ-1胞壁蛋白酶水解β-酪蛋白的最優(yōu)條件，按[E]/[S](w/w)為0.08的量加

4、入蛋白酶，調pH至8.0，在42℃下酶解4h后滅酶活，最后產品ACE抑制率為72.91%，總肽含量為12.68mg/ml。驗證試驗結果表明響應面分析法對于優(yōu)化酶解條件是可行的。掃描電鏡圖顯示β-酪蛋白酶解物的表面結構緊密性逐漸減弱，并伴有較多小孔洞出現(xiàn)；差示掃描量熱法DSC表明酪蛋白酶解物具有較高的熱穩(wěn)定性；此外CEP酶解使得酪蛋白酶解物中游離巰基含量增加，同時導致其酶解物抗氧化性的增加。
　　FTIR分析表明 CEP酶解改變了酪

5、蛋白各種構象所占的比例，酪蛋白二級結構發(fā)生了不同程度的變化；納米粒度分析表明酪蛋白顆粒大小隨水解的加深先減小后增大，其水解物顆粒在 DH4.5%時最小，乳化穩(wěn)定性最大；酪蛋白的乳化性隨水解的加深先增大后減小，DH7.1%時增至最大，與其溶解性的變化趨勢一致；此外酪蛋白的酶解物具有一定的ACE抑制活性及抗氧化性，且 DPPH清除能力在一定范圍內隨水解度及濃度的增大而增大，當 DH為8.3%，濃度為5mg/ml時，DPPH清除能力增大至35