丙醇-水中酪蛋白水解物的酶修飾與ACE抑制活性研究.pdf

1、高血壓是引起心肌梗塞、中風(fēng)、心力衰竭以及末期糖尿病等心血管疾病的可控的、主要的危險(xiǎn)因素。當(dāng)人體血壓下降5 mmHg時(shí)，心血管疾病發(fā)生的概率就下降16％。近年來，僅在美國，每年花費(fèi)在降壓藥的費(fèi)用就高達(dá)150億美元之多。然而，這些合成類降壓藥會(huì)給人們帶來各種各樣的副作用，因此，人們將更多的注意力轉(zhuǎn)移到從食源蛋白質(zhì)中獲得天然ACE抑制肽。很多研究表明，酪蛋白是獲取ACE抑制肽及其他生物活性肽的主要而豐富的來源。
　　 本研究以酪蛋白為

2、原料，對水解得到的酪蛋白水解物進(jìn)行丙醇-水介質(zhì)中的類蛋白反應(yīng)修飾，以期得到高活性的酪蛋白源ACE抑制肽。研究具體結(jié)果如下：
　　 (1)利用Alcalase2.4L FG蛋白酶水解酪蛋白，制備酪蛋白ACE抑制肽。酪蛋白水解物的ACE抑制活性最高值出現(xiàn)的水解時(shí)間為6h，其相應(yīng)的水解度為12.6%、ACE抑制活性為48.2%(樣品濃度為0.3 mg/mL)。
　　 (2)將底物濃度、反應(yīng)時(shí)間分別固定為45 g/100mL、6

3、 h，利用水相(以純水做溶劑)中心組合實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化出酪氨酸添加量(酪氨酸mol數(shù)與水解物游離氨基mol比)，通過DesignExpert7.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)、條件優(yōu)化，得出酪氨酸的適宜添加量為0.54 mol/mol。
　　 (3)利用中心組合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，優(yōu)化丙醇.水介質(zhì)中的類蛋白反應(yīng)條件。將類蛋白反應(yīng)時(shí)間固定為6h，以反應(yīng)體系中的游離氨基減少量為響應(yīng)值，根據(jù)Design Expert7，0軟件提供的30組實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行實(shí)

4、驗(yàn)，考察反應(yīng)溫度、酶添加量、底物濃度、丙醇體積分?jǐn)?shù)對類蛋白反應(yīng)的影響。由丙醇.水相響應(yīng)面可得出結(jié)論：所選的四個(gè)因素對類蛋白反應(yīng)的影響均非常顯著；利用響應(yīng)面法優(yōu)化條件，得到的最優(yōu)條件為反應(yīng)溫度46.8℃、酶添加量8.36 kU/g蛋白質(zhì)、底物濃度56.8 g/100mL、丙醇體積分?jǐn)?shù)58.5‰游離氨基減少量理論值為327.8μmol/g蛋白質(zhì)，實(shí)際值為344.5μmol/g蛋白質(zhì)。
　　 (4)利用丙醇-水相的優(yōu)化條件，制備反應(yīng)程

5、度不同的5個(gè)修飾產(chǎn)物，ACE抑制活性分析結(jié)果顯示，反應(yīng)時(shí)間為1 h的修飾產(chǎn)物抑制活性最高，可以達(dá)到63.8%。再在同樣條件下按0.54 mol/mol的比例分別添加酪氨酸和苯丙氨酸于反應(yīng)體系，制備出兩組反應(yīng)程度不同的修飾產(chǎn)物作為丙醇-水相對照試驗(yàn)，對比試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加苯丙氨酸或酪氨酸會(huì)導(dǎo)致修飾產(chǎn)物抑制活性增加或降低。利用丙醇-水相的優(yōu)化條件進(jìn)行純水相對照試驗(yàn)，以此條件制備出一組反應(yīng)程度不同的修飾產(chǎn)物。結(jié)果表明：水相類蛋白反應(yīng)的合成趨勢