Plastein反應修飾海地瓜酶解物制備ACE抑制肽及其機理研究.pdf

1、Plastein反應又稱為合成類反應或塑蛋白反應,是蛋白酶催化高濃度的蛋白水解物生成沉淀、觸變膠體或者具有觸變性粘稠膠狀物的過程;Plastein反應可應用于提高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值和功能特性、補充限制性氨基酸和去除酶解液的苦味等。ACE抑制肽可以通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅰ(ACE)的活性降低血壓,是用于治療高血壓的理想藥物;近些年研究發(fā)現(xiàn)Plastein反應修飾可以提高蛋白酶解物的ACE抑制活性,是改善ACE抑制肽活性的新途徑。Plast

2、ein反應是一個綠色的化學反應過程,具有很大應用價值和發(fā)展?jié)摿Α５?由于反應過程復雜,反應機理尚未明確,限制了它在實際工業(yè)生產(chǎn)中的應用。本文以海地瓜蛋白酶解物為原料,利用Plastein反應修飾海地瓜酶解物中的ACE抑制肽,以改善其活性,并對Plastein反應機理進行研究。
　　本文主要研究內(nèi)容如下:
　　1.利用Plastein反應修飾海地瓜酶解液中的ACE抑制肽,得到修飾肽的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制活性與原酶解

3、液活性相比,IC50值由0.44 mg/mL降低到0.12 mg/mL;用超濾、Sephadex G-15凝膠層析和RP-HPLC等分離技術(shù)純化 Plastein修飾產(chǎn)物,逐步提高 ACE抑制肽的活性,鑒定所得肽的序列結(jié)構(gòu)為NQNFVQYTTNT(IC50值3.67μmol/L),在肽庫中檢索沒有發(fā)現(xiàn)相同序列,推測這可能是由Plastein反應合成的新肽;通過計算機輔助藥物設計軟件SYBYL模擬抑制肽與ACE活性區(qū)域的結(jié)合情況,確定了抑

4、制肽與ACE的結(jié)合位點。
　　2.以Plastein反應修飾的抑制肽為研究對象,研究修飾肽與ACE結(jié)合前后的紫外變化,推測修飾肽與ACE發(fā)生了有效結(jié)合;通過測定修飾產(chǎn)物對MDCK細胞的毒性,表明其濃度在10 mg/mL的范圍內(nèi)對MDCK細胞沒有毒性,且低濃度時還可以促進細胞生長;經(jīng)胃腸蛋白酶模擬消化后ACE抑制活性是原來的1.56倍,說明修飾肽與胃腸蛋白酶作用后可以進一步增強其活性,是前體型藥物;穩(wěn)定性實驗表明,ACE不影響修飾肽

5、的降壓活性。
　　3. Plastein修飾產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)表征。通過紅外光譜和圓二色譜分析,表明酶解物發(fā)生Plastein反應后有二級結(jié)構(gòu)出現(xiàn),如無規(guī)則卷曲和β-折疊等;熱力學性質(zhì)研究表明,Plastein反應可顯著增加海地瓜酶解物的熱穩(wěn)定性,在分子內(nèi)部和分子間形成較強作用力,使變性溫度由129.86℃升高至134.18℃,焓變ΔH由酶解液的21.8 J/g升高至79.7 J/g;X-射線衍射結(jié)果表明,Plastein反應使物質(zhì)原

6、有的空間排布發(fā)生改變,形成了新的物質(zhì)結(jié)構(gòu);掃描電鏡結(jié)果表明,Plastein反應產(chǎn)物具有類似于完整蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),說明Plastein反應產(chǎn)物不同于酶解物,它包含較強的作用力并具有一定的空間結(jié)構(gòu)。
　　4. Plastein反應機理的研究。測定Plastein反應過程中游離氨基酸含量減少及封閉反應體系中游離氨基端和羧基端后Plastein反應產(chǎn)率下降,證明反應過程中發(fā)生了縮合反應;測定產(chǎn)物中大分子量物質(zhì)沒有增加,而游離氨基酸含量

7、卻減小,說明反應機理中包含轉(zhuǎn)肽作用?？s合作用和轉(zhuǎn)肽作用共同導致新的共價鍵生成,是Plastein反應應用于提高蛋白質(zhì)或肽的功能性質(zhì)方面的主要原因,也使海地瓜酶解液的 ACE抑制活性經(jīng)過 Plastein反應修飾后提升。同時非共價鍵、疏水交互作用、氫鍵和離子鍵對形成Plastein修飾產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有重要作用;因此,海地瓜酶解液的Plastein反應包括在底物與酶相互作用下由縮合反應和轉(zhuǎn)肽反應形成新的共價鍵,與非共價鍵參與的物理聚集等,共同