酶法制備草魚魚鱗明膠及ACE抑制肽的研究.pdf

1、我國是世界上唯一水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量超過捕撈產(chǎn)量的國家，其中養(yǎng)殖草魚的產(chǎn)量占世界養(yǎng)殖草魚總產(chǎn)量的90％以上。魚鱗是魚產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生的下腳料之一，富含膠原蛋白，但由于受技術(shù)、觀念等的影響，沒有得到充分的利用，被當(dāng)作廢棄物扔掉。這不僅造成資源的巨大浪費，而且造成環(huán)境污染。以魚鱗為原料采用酶法制備明膠和具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)活性的膠原肽，既充分利用了魚鱗資源，減少環(huán)境污染，又可以生產(chǎn)出高附加值的產(chǎn)品，同時還解決了由口蹄疫、瘋牛病等帶來

2、的明膠安全問題，產(chǎn)生重大的經(jīng)濟效益和社會效益。
　　 本論文以草魚魚鱗為原料，采用酶法制備魚鱗明膠和ACE抑制肽，主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 采用鹽酸溶液對草魚魚鱗進行脫鈣，確定最佳的脫鈣工藝條件為：0.4mol/L的鹽酸脫鈣90min，料液比1∶15，不停攪拌。
　　 研究了脫鈣條件以及鈣離子對草魚魚鱗膠原的影響。研究發(fā)現(xiàn)魚鱗膠原的溶出量隨脫鈣時間的延長而增加，脫鈣液鹽酸濃度在0.2mol/L～0.8mol

3、/L的范圍內(nèi)時，膠原的溶出量隨鹽酸濃度增加而降低。鹽酸濃度在0.2～0.6mol/L的范圍內(nèi)，鹽酸濃度的變化對膠原纖維收縮溫度的影響不明顯，如鹽酸濃度繼續(xù)增加，脫鈣后膠原纖維的穩(wěn)定性將下降，收縮溫度由64℃變?yōu)?2℃。鈣離子與魚鱗膠原中的-C=O以配位鍵結(jié)合破壞了膠原分子內(nèi)與分子間的氫鍵，使得膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)變松，分子直徑變大，膠原穩(wěn)定性下降，分子之間不能相互交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
　　 對脫鈣后的草魚魚鱗膠原纖維的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進行了

4、分析。結(jié)果表明魚鱗膠原纖維富含脯氨酸、甘氨酸和羥脯氨酸，此外還含有較多的丙氨酸，缺乏色氨酸，組氨酸含量較少；草魚魚鱗膠原纖維收縮溫度為63.5℃；X-射線衍射測定魚鱗膠原結(jié)構(gòu)表明，草魚魚鱗膠原為三股螺旋結(jié)構(gòu)，其中每條鏈?zhǔn)仟毩⒌淖笫致菪Y(jié)構(gòu)。
　　 采用酶代浸灰法對脫鈣后的草魚魚鱗進行預(yù)處理，從魚鱗明膠的得率、粘度及凝膠強度三方面綜合考慮，由六種蛋白酶中選擇金屬肽酶Protease A作為預(yù)處理魚鱗的最適酶種。經(jīng)響應(yīng)面分析得出Pr

5、oteaseA最佳的酶解條件為：底物濃度10％(w/v)，酶解溫度30.4℃，酶的添加量0.24％(w/w)，酶解時間5.5h，酶解pH值為7.0，90℃滅酶10min。經(jīng)Protease A酶解處理后的魚鱗中膠原含量增加，約為91.04％，占草魚魚鱗蛋白總量的96.80％，魚鱗膠原纖維的收縮溫度降至55.88℃，酶解處理降低了草魚魚鱗膠原纖維的結(jié)晶度。
　　 對酶解預(yù)處理后的魚鱗用熱水提取明膠，經(jīng)單因素及正交實驗確定熱水提取草

6、魚魚鱗明膠的最佳條件為：pH為6，溫度為55℃，時間為5h，料水比為1∶10。在此條件下放大試驗規(guī)模制取的草魚魚鱗明膠的得率為60.23％(w/w)，粘度8.32mpa·s，凝膠強度為290g(bloom)。X-射線衍射圖譜表明干態(tài)存在的明膠中含有～定量的三股螺旋結(jié)構(gòu)，當(dāng)明膠溶于熱水，形成明膠溶液時，圓二色圖譜顯示三股螺旋結(jié)構(gòu)消失。
　　 研究了最佳提取工藝條件下得到的草魚魚鱗明膠的物理化學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明草魚魚鱗明膠的氨基酸組成

7、中缺乏色氨酸，富含甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸和丙氨酸；亞氨基酸、總疏水性氨基酸的含量以及平均疏水性值要小于哺乳動物明膠。由分子量分布測定可知，草魚魚鱗明膠的分子量分布主要以α組分和β組分為主，占明膠分子總量的88％，草魚魚鱗明膠的凝膠強度和膠凝速度主要取決于明膠組分(α+β)的含量。特性粘度約為0.73，等電點7左右，表面疏水性指數(shù)為259.59，膠凝溫度和熔化溫度分別為20.8℃和26.9℃，魚鱗明膠腥味物質(zhì)顯著減少，幾乎嗅聞不到魚腥味

8、。
　　 利用蛋白酶水解提膠之后的魚鱗殘渣制備ACE抑制肽，從酶解產(chǎn)物的肽得率、相對分子質(zhì)量分布和ACE抑制活性三方面考慮，由六種蛋白酶中選擇A.S.1398中性蛋白酶作為水解魚鱗膠原蛋白的最佳酶種。經(jīng)單因素試驗確定A.S.1398的最適酶解條件為：溫度50℃，pH6.5，加酶量6％(w/w)，底物濃度5％(w/v)，酶解時間3h。酶解產(chǎn)物中相對分子質(zhì)量在1500以下的寡肽占到90％以上，經(jīng)DA201-C大孔吸附樹脂脫鹽后，魚鱗

9、ACE抑制肽的半抑制濃度IC50為0.45mg/mL。
　　 采用大孔吸附色譜、凝膠色譜、半制備RP-HPLC和分析型RP-HPLC分離純化魚鱗ACE抑制肽，得到G5-R3-1單一組分，通過串聯(lián)質(zhì)譜鑒定得到具有較高抑制活性的六肽，Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg，該肽段的IC50約為52.1μM。
　　 通過魚鱗ACE抑制肽對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響探討其抗血壓機制。結(jié)果顯示魚鱗ACE抑制肽能抑制人臍靜脈

10、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，且不引起細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞阻滯于S期。魚鱗ACE抑制肽能顯著降低人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ET-1的含量，且純肽(Fish scale collagen single peptides，F(xiàn)SCSP)的抑制效果與同等濃度的混合肽(Fishscale collagen peptides，F(xiàn)SCPs)相近。實時定量熒光PCR結(jié)果顯示，中低劑量的FSCPs上調(diào)ACE2mRNA的表達(dá)，高劑量的FSCPs能下調(diào)ACEmRNA的表達(dá)。