核桃蛋白源ACE抑制劑肽的酶法制備及分離、純化.pdf

1、高血壓是一種常見的心血管疾病，是導(dǎo)致中風(fēng)、冠心病、心力衰竭、心臟病等疾病的重要危險(xiǎn)因子，現(xiàn)已成為世界各國(guó)重要的公共健康問(wèn)題。研究表明，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(agiotensinconvertingenzyme，ACE)抑制肽能通過(guò)腎素-血管緊張素系統(tǒng)，降低血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性，從而有效降低血壓。近年來(lái)，各種食源性ACE抑制肽因其具有成本低、易吸收、無(wú)毒副作用、安全性高等優(yōu)勢(shì)，已成為生物活性肽領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
　　 核桃作為四大堅(jiān)果

2、之一，是傳統(tǒng)的滋補(bǔ)保健食品，酶解核桃蛋白制備ACE抑制肽具有很好的消費(fèi)者認(rèn)知基礎(chǔ)，此外，核桃蛋白質(zhì)中脯氨酸(4％左右)含量較高，有研究表明，其對(duì)ACE抑制肽有突出貢獻(xiàn)，因此核桃蛋白是一種理想的ACE抑制肽蛋白來(lái)源。制備核桃ACE抑制肽不僅能夠顯著增加核桃的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，提高其精深加工的水平，而且可以為高血壓病人提供輔助降壓的功能食品，為新降壓藥物的開發(fā)提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　 該文以堿溶酸沉法得到的核桃分離蛋白(walnutprotei

3、nisolate，WPI)為底物，通過(guò)不同的蛋白酶水解，以水解度（degreeofhydrolysis，DH）和ACE抑制活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別研究了其酶解工藝，優(yōu)化了酶解工藝參數(shù);以核桃蛋白酶解物為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)超濾、大孔吸附樹脂、凝膠過(guò)濾色譜等手段分離、純化ACE抑制肽，得到了以下主要結(jié)果:
　　 首先，研究了三種方法（甲醛滴定法、pH-Stat法和TNBS法）測(cè)定核桃蛋白酶解物的DH，結(jié)果表明，不同方法測(cè)定DH結(jié)果與酶解所用

4、的蛋白酶性質(zhì)和底物氨基酸組成有關(guān)，pH-Stat法是較為適合測(cè)定核桃蛋白酶解物DH的方法，其具有簡(jiǎn)便易行、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DH等優(yōu)點(diǎn)。
　　 其次，分別采用Protamex、ProleatherFG-F、Alcalase2.4L、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶七種酶來(lái)酶解WPI，結(jié)果表明，Protamex、Alcalase2.4L和中性蛋白酶三種核桃蛋白酶解物ACE抑制率較高，體外模擬消化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Alcalase2.4

5、L同時(shí)具有良好的抗消化酶穩(wěn)定性，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用Alcalase2.4L酶解WPI制備ACE抑制肽;通過(guò)單因素和二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合優(yōu)化試驗(yàn)，得到Alcalase2.4L酶解WPI最適酶解條件:底物濃度20g/L、溫度60℃、pH值7.94，E/S3.69％，酶解時(shí)間為4h。在此條件下制備核桃蛋白Alcalase2.4L酶解物，其DH為24.78％，ACE抑制率為76.58％。成分測(cè)定結(jié)果表明，核桃蛋白Alcalase2.4L酶解物氨基

6、酸組成合理，其疏水性氨基酸含量較高，對(duì)ACE抑制活性有重要影響，同時(shí)，其灰分含量較高。
　　 接著，分別選用截留分子量(MWCO)50KDa、10KDa、5KDa、1KDa的膜對(duì)核桃蛋白Alcalase2.4L酶解物進(jìn)行超濾分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超濾后各組分ACE抑制率存在較大差異，其中，MWCO為1KDa透過(guò)液組分ACE抑制活性最高，達(dá)到78.43％，半數(shù)抑制濃度IC50為2.055mg/mL，肽回收率為30.71％。采用大孔吸附樹

7、脂對(duì)超濾后的活性組分進(jìn)行脫鹽處理，根據(jù)吸附和解析性能選擇DA201-C作為最佳樹脂。上樣pH4.0，以75％乙醇為洗脫劑，經(jīng)過(guò)大孔吸附樹脂純化后，脫鹽率達(dá)到92.1％，多糖含量下降至3.83％，脫鹽純化后核桃多肽含量達(dá)90.30％，ACE抑制率為80.73％，IC50為1.65mg/mL，均比純化前有所提高。
　　 最后，通過(guò)SephadexG-15對(duì)脫鹽后組分進(jìn)一步純化，結(jié)果表明，其最適洗脫條件為:洗脫劑為蒸餾水，樣品上樣濃度