羊乳源ACE抑制肽制備、分離純化及鑒定.pdf

1、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）是引起高血壓患者血壓升高的主要原因之一，抑制ACE的活性是降血壓的重要途徑。臨床上大多以合成藥物治療高血壓，長期服用有副作用。以乳源制備的ACE抑制肽能有效抑制ACE活性，且安全無毒副作用。陜西羊乳資源優(yōu)勢明顯，但羊乳產(chǎn)品主要以嬰幼兒配方羊奶粉和大包裝工業(yè)奶粉為主，產(chǎn)品同質(zhì)化嚴(yán)重。本課題以羊乳為原料，篩選適宜發(fā)酵羊乳產(chǎn) ACE抑制肽的菌株并鑒定，研究發(fā)酵和酶解法制備羊乳源ACE抑制肽的最佳工藝，超濾、凝膠色譜及

2、RP-HPLC分離純化ACE抑制肽，基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI/TOF-TOF MS/MS）對其進行鑒定。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）篩選及鑒定了發(fā)酵羊乳產(chǎn) ACE抑制肽的益生乳桿菌菌株。發(fā)現(xiàn)28株乳桿菌中有19株的發(fā)酵羊乳具有ACE抑制活性，其ACE抑制率介于2.27±0.09％－85.52±2.59%之間，其中ACE抑制率高于60%的4株菌，分別為LB6、LR22、LT33和LP69，經(jīng)16S rDN

3、A鑒定表明，其分別為徳氏乳桿菌保加利亞亞種(L. delbrueckii subsp. bulgaricus)、鼠李糖乳桿菌(L. rhamnosus)、羅伊氏乳桿菌(L. reuteri)和植物乳桿菌(L. plantarum）。
　?。?）采用單因素、主因素篩選及響應(yīng)面法優(yōu)化了保加利亞乳桿菌LB6和植物乳桿菌LP69發(fā)酵羊乳產(chǎn)ACE抑制肽條件。保加利亞乳桿菌LB6的產(chǎn)肽條件為：乳清粉添加量0.80%，乳酸鈣添加量0.50%，巴

4、氏殺菌15min，接種量5.0%，35℃發(fā)酵12h，其ACE抑制率為85.88±0.63%，比對照組高10.64%。植物乳桿菌L69的產(chǎn)肽條件為：溫度為35℃、氯化鈣和吐溫80濃度分別為0.07%和0.04%，其 ACE抑制率為88.91±0.52%，較對照組高19.48%。
　?。?）優(yōu)化了保加利亞乳桿菌 LB6和植物乳桿菌 LP69產(chǎn)肽培養(yǎng)基。Plackett-Burman篩選結(jié)果表明：保加利亞乳桿菌LB6產(chǎn)肽培養(yǎng)基的主因子為

5、大豆蛋白胨、葡萄糖和酪蛋白，其培養(yǎng)基組成（g/L）為：羊奶粉110g，大豆蛋白胨3.0g、葡萄糖1.15g、酪蛋白1.50g，經(jīng)驗證其 ACE抑制率為92.31±0.56%。植物乳桿菌LP69產(chǎn)肽培養(yǎng)基的主成分為乳糖和酪蛋白，產(chǎn)肽培養(yǎng)基（g/L）為：羊奶粉140g，乳糖4.9g，酪蛋白濃度2.3g，經(jīng)驗證ACE抑制率為89.16±0.54%。
　?。?）優(yōu)化了酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽工藝及獲得了酶解動力學(xué)參數(shù)。5種商業(yè)蛋白酶

6、水解羊乳酪蛋白酶解液的 ACE抑制率為：Alcalase>胰蛋白酶>蛋白酶 K>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶。Alcalase和胰蛋白酶水解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的酶解工藝條件為：底物羊乳酪蛋白為10%、酶添加量為8.25%、Alcalase和胰蛋白酶比例為1:1、pH值為8.4、69℃恒溫水解90min，雙酶水解液的ACE抑制率達(dá)到了91.99±1.18%，其酶解羊乳酪蛋白的反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)為Km=0.127 mg/mL，Vmax=0.1

7、54mg/mL·min，雙酶酶解優(yōu)于單酶。
　?。?）分離純化及鑒定了羊乳源ACE抑制肽。LB6FM、LP69FM和GCH ACE抑制肽的 IC50值分別為0.677mg/mL、0.502mg/mL和0.729mg/mL， LP69FM的ACE抑制活性最強；超濾結(jié)果表明，ACE抑制肽均集中于分子量小于1000Da的組分中，其IC50值分別為0.348mg/mL、0.312mg/mL和0.284 mg/mL，凝膠色譜分離純化表明，L

8、B6FM、LP69FM和GCH抑制活性最高的組分分別為 F2、G2和 H2-2， ACE抑制活性強弱為：G2（ IC50為0.125mg/mL）＞H2-2（IC50為0.134mg/mL）＞F2（IC50為0.150mg/mL）。經(jīng)RP-HPLC和MALDI/TOF-TOF-MS/MS分離鑒定出9條ACE抑制肽，經(jīng)與 Mascot、AHTPDB、SwePep、PepBank和 EROP-Moscow等數(shù)據(jù)庫和文獻比對表明，SKK、RHP