柱狀黃桿菌嗜熱菌蛋白酶基因的鑒定.pdf

1、用兔抗F. columnare外膜蛋白多抗從其表達(dá)文庫中篩選出嗜熱菌蛋白酶(TLN)基因，其開放閱讀框包含2709nt，編碼902aa。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)TLN含有兩個鋅金屬蛋白酶保守基序HExxH和(GxxNExxSD說明其屬于嗜熱菌蛋白酶家族。將TLN催化域和α螺旋域克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳顯示重組融合蛋白TLN-C在分子量約58kD處有

2、明顯表達(dá)帶，主要以不可溶的包涵體形式存在。變性條件下利用His·Bind樹脂純化融合蛋白，用其免疫新西蘭大白兔，獲得兔抗重組TLN-C多克隆抗體。用抗六個組氨酸的單抗或是兔抗重組蛋白多抗血清為第一抗體對重組蛋白進(jìn)行免疫印跡實驗，結(jié)果顯示，重組蛋白(58kD)均能與其發(fā)生較強的陽性反應(yīng)，說明制備的多抗血清有效。用兔抗重組蛋白多抗血清為第一抗體對柱狀黃桿菌胞外蛋白和外膜蛋白進(jìn)行印跡實驗，結(jié)果顯示，胞外蛋白在約42kD蛋白條帶處有陽性反應(yīng)，說