云南騰沖熱泉嗜熱微生物的遺傳多樣性及嗜熱角蛋白酶和脂肪酶的研究.pdf

1、來(lái)源于極端嗜熱環(huán)境嗜熱菌的酶類(lèi)具有極好的高溫反應(yīng)活性和穩(wěn)定性，在能源、化工、食品和醫(yī)藥等行業(yè)展現(xiàn)出越來(lái)越廣闊的應(yīng)用潛力。了解嗜熱環(huán)境中嗜熱微生物的分布情況，可為在嗜熱環(huán)境中篩選嗜熱菌，分離純化嗜熱酶提供基礎(chǔ)。嗜熱酶因?yàn)橛辛己玫膽?yīng)用前景而備受關(guān)注，對(duì)于嗜熱酶穩(wěn)定性相關(guān)的結(jié)構(gòu)特征的研究，將揭示酶高溫反應(yīng)機(jī)制的分子基礎(chǔ)，為將來(lái)發(fā)現(xiàn)嗜熱酶的新功能，指導(dǎo)酶分子設(shè)計(jì)和改造提供必要的理論依據(jù)。本論文研究主要包括以下幾個(gè)部分：
　　 1.云南騰

2、沖熱泉的嗜熱微生物遺傳多樣性分析
　　 由于傳統(tǒng)的菌株分離方法不夠全面，分離到的可培養(yǎng)的菌株只能代表自然環(huán)境中嗜熱菌群的一小部分。隨著未可培養(yǎng)方法的完善和發(fā)展，已經(jīng)有能力對(duì)環(huán)境中那些行駛重要功能但是目前沒(méi)有辦法分離的嗜熱微生物進(jìn)行群落分析和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等方面的研究。在本研究中，我們從云南騰沖熱泉中選取了7個(gè)不同的取樣地點(diǎn)的泥樣樣品，利用未可培養(yǎng)方法研究熱泉群落中的多樣性。以熱泉泥樣中提取的環(huán)境總DNA為模板，得到的16S rDN

3、A基因序列，建立進(jìn)化樹(shù)分析。發(fā)現(xiàn)熱泉環(huán)境中存在著大量的未培養(yǎng)的嗜熱微生物，包括嗜熱細(xì)菌和嗜熱古菌。由于不同的熱泉環(huán)境中成分的不同，我們?cè)诓煌臒崛c(diǎn)得到不同的嗜熱菌的信息。基于得到的16S rDNA序列分析，我們了解到環(huán)境中存在著大量的未可培養(yǎng)的嗜熱微生物，這也說(shuō)明了我們所使用的傳統(tǒng)分離方法的局限性。進(jìn)一步分析表明，無(wú)論是分離到的菌株，還是DNA水平得到的序列都不能真實(shí)地反映在嗜熱環(huán)境中具有較高的代謝活性、行使生態(tài)功能的嗜熱菌群的組成。

4、但是我們的研究結(jié)果對(duì)了解騰沖熱泉中沒(méi)有鑒定的嗜熱的細(xì)菌和嗜熱古菌提供了重要依據(jù)，為將來(lái)的嗜熱菌的分離和其中嗜熱酶的研究提供基礎(chǔ)。
　　 2.羽毛降解角蛋白酶菌株篩選及酶學(xué)性質(zhì)鑒定
　　 角蛋白是一種不可溶的、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，羽毛的主要成分是角蛋白，不能被一般的蛋白酶降解。我國(guó)羽毛角蛋白資源豐富，畜禽類(lèi)羽毛蘊(yùn)含了大量潛在的蛋白質(zhì)和氨基酸，若合理利用可作為優(yōu)質(zhì)飼料蛋白。但是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定，極難降解，所以找到合適的方法是研究

5、降解角蛋白的關(guān)鍵。傳統(tǒng)物理、化學(xué)降解法存在眾多缺陷，諸如效率低、耗能高、污染大，而采用微生物降解法效果顯著，既利用了蛋白資源，也有利于環(huán)境保護(hù)。因此角蛋白及角蛋白酶的研究有廣闊的應(yīng)用前景及較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。我們?cè)隍v沖熱泉中篩選到一株好氧的嗜熱芽孢桿菌，對(duì)其進(jìn)行了生理生化鑒定和16S rDNA進(jìn)行了分析，鑒定該菌株屬于Geobacillus，命名為Geobacillus sp.RD-2，該菌株的最適生長(zhǎng)溫度是60℃，最適生長(zhǎng)pH7

6、.5。利用不同的純化方法，在胞外得到了角蛋白酶，分子量大小約為65 kDa。以天青角蛋白為底物，檢測(cè)該酶的生化性質(zhì)，結(jié)果表明該嗜熱酶的酶活最適溫度是75℃，最適pH8.0。另外我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入DTT后，角蛋白酶的活性增加兩倍以上，這個(gè)結(jié)果表明還原劑能夠協(xié)助酶打斷底物的二硫鍵，使酶更容易作用底物。以上研究表明，得到的嗜熱角蛋白酶可能在工業(yè)上有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 3.嗜熱脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)研究及殘基Y224突變對(duì)酶熱穩(wěn)定性的影響

7、r>　　 近年來(lái)，來(lái)自嗜熱菌的嗜熱脂肪酶得到了廣泛的關(guān)注，主要是由于其熱穩(wěn)定性使嗜熱脂肪酶能夠在工業(yè)生產(chǎn)中得到更為廣泛的應(yīng)用。我們?cè)贕eobacillus sp.RD-2的基因組中克隆到一個(gè)脂肪酶lipGRD基因，并在大腸桿菌中和畢赤酵母中表達(dá)了lipGRD蛋白。經(jīng)熱處理，Ni-NTA柱親和層析純化，得到了純化的重組lipGRD蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示，lipGRD蛋白單體分子量為43.0 KDa。對(duì)其進(jìn)行了生化性質(zhì)鑒定，其酶活

8、的最適溫度是55℃，最適pH是7.5，并且有比較好的耐熱性。
　　 在基因克隆中我們偶然得到了一個(gè)不耐熱的突變體，研究發(fā)現(xiàn)lipGRD氨基酸序列的224位酪氨酸變?yōu)榘腚装彼岷?，酶喪失了耐熱性，酶的最適溫度是35℃。對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行了一系列的飽和誘變分析，發(fā)現(xiàn)酪氨酸變?yōu)楦彼岷螅傅臒岱€(wěn)定性得到了提高，酶的最適溫度是65℃。
　　 根據(jù)Geobacillus stearothermophilus L1脂肪酶的晶體結(jié)構(gòu)，模擬出l

9、ipGRD的結(jié)構(gòu)圖，酶的活性位點(diǎn)被一個(gè)長(zhǎng)的“蓋子”α6螺旋所覆蓋，高溫的條件下，“蓋子”打開(kāi)，暴露出活性位點(diǎn)，因此，α6螺旋被稱(chēng)為溫度開(kāi)關(guān)，Tyr224位于α6螺旋下游的α7螺旋上，有報(bào)道說(shuō)中溫酶中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)α7-α9結(jié)構(gòu)，可能是嗜熱酶所特有的結(jié)構(gòu)，能夠控制酶的熱穩(wěn)定性。對(duì)于突變體lipGRD/Y224C，224位的半胱氨酸可能和64位的半胱氨酸形成二硫鍵，改變了蛋白的結(jié)構(gòu)，推測(cè)影響了溫度開(kāi)關(guān)α6的狀態(tài)，從而在低溫下暴露出活性位點(diǎn)與底物反