福州溫泉嗜熱菌多樣性及嗜熱菌Geobacillus thermoglucosidasius低溫適應(yīng)的機(jī)制.pdf

1、溫泉是地球上一類重要的熱環(huán)境，其高溫和貧營養(yǎng)環(huán)境中生存著大量的嗜熱微生物。嗜熱菌是一類重要的微生物，在生存機(jī)制和應(yīng)用方面都吸引著越來越多關(guān)注。地球上不同地區(qū)溫泉嗜熱菌組成差異很大，對(duì)不同地區(qū)溫泉中嗜熱菌多樣性研究有利于加深對(duì)該類生態(tài)系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。地芽孢桿菌屬（Geobacillus）是溫泉可培養(yǎng)嗜熱菌中的優(yōu)勢(shì)菌，也是堆肥等熱環(huán)境中的常見菌種，但是隨著近年來在常溫和寒冷環(huán)境中不斷分離到Geobacillus屬菌株，這類嗜熱菌適應(yīng)低溫生存的機(jī)

2、制引起人們關(guān)注。本論文通過調(diào)查福州三處溫泉的嗜熱菌多樣性，發(fā)現(xiàn)Geobacillus屬細(xì)菌在溫泉熱環(huán)境中廣泛分布，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了Geobacillus屬細(xì)菌的低溫適應(yīng)機(jī)制。
　　本研究應(yīng)用Illumina MiSeq平臺(tái)檢測福州大湯（DaTang)、湯埕(TangCheng)和雙龍(ShuangLong)三處溫泉水體中的細(xì)菌16S rDNA多樣性，顯示三處溫泉中嗜熱菌多樣性豐富，其中豐度較大的嗜熱菌有變形菌門（ Prote

3、obacteria），厚壁菌門（Firmicutes），產(chǎn)水菌門(Aquificae)，硝化螺旋菌門（Nitrospirae），裝甲菌門（Armatimonadetes），棲熱菌門（Thermi），GAL15菌門，酸桿菌門（Acidobacteria），綠菌門（Chlorobi），放線菌門（Actinobacteria），綠彎菌綱（Chloroflexi），OP1菌門，OD1菌門，擬桿菌門（Bacteroidetes）和EM3菌門。不同

4、溫泉之間細(xì)菌多樣性差異較大，Pearson相關(guān)性分析和RDA分析顯示三處溫泉微生物多樣性的差異與溫泉溫度、Na+、NO2-和Mg2+等水體理化性質(zhì)有關(guān)。對(duì)福州地區(qū)三個(gè)典型溫泉：大湯溫泉、湯埕溫泉和雙龍溫泉溫泉底泥中的可培養(yǎng)嗜熱菌進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示大湯溫泉嗜熱菌的種類多于湯埕，雙龍溫泉嗜熱菌最少。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)三個(gè)溫泉嗜熱菌多樣性與pH，堿解氮和有效磷有關(guān)，pH越低，堿解氮和有效磷含量越高溫泉中嗜熱菌越豐富。所分離的32株嗜熱菌隸屬于6

5、個(gè)不同的屬，其中Geobacillus屬和Anoxybacillus屬菌株為福州溫泉中的優(yōu)勢(shì)嗜熱菌菌種?？膳囵B(yǎng)方式和非可培養(yǎng)方式研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)溫泉中可培養(yǎng)菌只占非常小一部分，堅(jiān)壁菌門中產(chǎn)芽孢細(xì)菌較易培養(yǎng)；棲熱菌，變形菌等嗜熱菌沒有從現(xiàn)有的培養(yǎng)方式中得到純培養(yǎng)物。改善可培養(yǎng)方式或者應(yīng)用宏基因組學(xué)手段有利于進(jìn)一步挖掘溫泉嗜熱菌基因資源。對(duì)分離的一株嗜熱菌Geobacillus sp. CHB1進(jìn)行了鑒定和基因組測序。該菌生長溫度范圍為47oC

6、~74oC之間，最適生長溫度為60oC。16S rDNA測序發(fā)現(xiàn)該菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株Geobacillus thermoglucosidasius DSM2542T同源性最近為99.26％。該菌的G+C含量為49%，與Geobacillus thermoglucosidasius DSM2542T基因組雜交率為75%。但是其與標(biāo)準(zhǔn)菌株Geobacillus thermoglucosidasius DSM2542T在生理生化特征和細(xì)胞膜磷脂脂肪

7、酸組成方面又有所不同，判斷該菌株為 Geobacillus thermoglucosidasius種的一個(gè)亞種。對(duì)Geobacillus sp. CHB1基因組進(jìn)行測序，該菌株基因組長度為3.22M，編碼4122個(gè)開放閱讀框。
　　本研究以Geobacillus sp. CHB1為目標(biāo)菌株，應(yīng)用適應(yīng)性進(jìn)化技術(shù)（Experimental evolution）向低于其最低生長溫度的方向進(jìn)化，經(jīng)過6個(gè)月的實(shí)驗(yàn)得到了可以在43oC溫度下起

8、始生長的進(jìn)化菌株。進(jìn)化菌株生長速度明顯高于初始菌株。進(jìn)化菌株Ec細(xì)胞膜磷脂脂肪酸在低溫下表現(xiàn)出劇烈調(diào)整的傾向，iso15:00在45oC低溫生長時(shí)相對(duì)含量顯著上升，這也從另一個(gè)方面證明了進(jìn)化后的菌株對(duì)低溫的適應(yīng)能力更好。比較蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)進(jìn)化菌株與核苷酸相關(guān)的蛋白表達(dá)量上調(diào)，而與脂肪酸代謝相關(guān)的蛋白表現(xiàn)下調(diào)。蛋白組學(xué)結(jié)果與進(jìn)化菌株表現(xiàn)出較高的生長速度和較強(qiáng)的脂肪酸調(diào)節(jié)能力是相一致的。在前期6個(gè)月進(jìn)化的基礎(chǔ)上，以Ec為出發(fā)菌株又繼續(xù)向更低生

9、長溫度進(jìn)行了12個(gè)月的進(jìn)化實(shí)驗(yàn)。溫度生長實(shí)驗(yàn)證明，液體培養(yǎng)條件下三個(gè)進(jìn)化群體（F1、F2和F3)都可以在38-39oC之間穩(wěn)定生長傳代，固體平板實(shí)驗(yàn)證明進(jìn)化群體中挑取的菌株F3可以在39oC溫度條件下生長并形成菌落。這些證明，在Ec的基礎(chǔ)上，經(jīng)過12個(gè)月的進(jìn)化實(shí)驗(yàn)，該菌的最低生長溫度又下降了至少4oC。對(duì)進(jìn)化群體Ec，F(xiàn)2和F3進(jìn)行重測序分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)群體有15個(gè)共有的突變基因，其中7個(gè)基因在兩個(gè)群體中突變位置不同，說明這些基因很可能在

10、這個(gè)階段適應(yīng)低溫的過程中起到重要的作用。比較基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)MFS、DNA聚合酶β亞基、AB水解酶和肽酶等是獨(dú)立適應(yīng)低溫進(jìn)化的群體共有的突變基因，認(rèn)為這些基因是與低溫適應(yīng)有關(guān)的潛在基因突變。從F3群體中挑取兩個(gè)單菌落重測序，發(fā)現(xiàn)個(gè)體基因組中雜合子明顯少于其對(duì)應(yīng)的群體F3，說明在適應(yīng)低溫進(jìn)化過程中群體內(nèi)菌株間積累了大量的不同的突變，這些突變有些還沒有在群體中固定下來。在這個(gè)階段Ec適應(yīng)更低溫度的進(jìn)化過程中還出現(xiàn)了一些突變體，F(xiàn)3群體中出現(xiàn)了細(xì)

11、胞分裂被抑制的長線形菌體，通過比較基因組結(jié)果發(fā)現(xiàn)該群體中FtsK基因發(fā)生了倒位突變。這些結(jié)果加深了對(duì)嗜熱菌適應(yīng)低溫的機(jī)制的理解。過氧化氫酶在獨(dú)立進(jìn)化的群體EA、EB和EC均表現(xiàn)出比初始菌株A高出20倍以上的過氧化氫酶活性。質(zhì)譜鑒定證明起作用的過氧化氫酶是一種攜帶血紅素的單功能過氧化氫酶，針對(duì)該基因的qPCR進(jìn)一步證明其在進(jìn)化菌株中高表達(dá)。進(jìn)化菌株的發(fā)酵液和重組過氧化氫酶都顯示出該過氧化氫酶在0℃~40℃溫度范圍內(nèi)至少有40%以上的活性，