海棲熱袍菌中嗜熱酶基因的克隆及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、二十一世紀(jì)，開(kāi)發(fā)和利用海洋生物資源已成為全球關(guān)注點(diǎn)之一，對(duì)極端海洋環(huán)境微生物的研究也上了一個(gè)新層次。因此對(duì)極端酶的研究也廣泛引起了海內(nèi)外專(zhuān)家的興趣，尤其嗜熱酶已經(jīng)在許多領(lǐng)域有了較好的應(yīng)用。海棲熱袍菌（Thermotoga maritime）是一種來(lái)源于深?；鹕降臉O端嗜熱菌，生長(zhǎng)環(huán)境特殊難以大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)，其酶資源用于工業(yè)化生產(chǎn)十分困難。使用基因工程手段對(duì)極端環(huán)境微生物的酶基因加以克隆并進(jìn)行高效表達(dá)，是目前利用極端環(huán)境微生物酶資源的主要

2、方法。
　　本課題主要研究了海棲熱袍菌表達(dá)的內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶(TM1525)、阿拉伯內(nèi)切-1，4-β-半乳聚糖酶(TM1201)、磷酸戊糖變位酶(TM1067)三種嗜熱酶。采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建表達(dá)嗜熱酶的基因工程菌，通過(guò)層析柱處理加以純化成功表達(dá)的外源蛋白酶，已有文獻(xiàn)報(bào)道嗜熱磷酸戊糖變位酶（PPM）的主要酶活性質(zhì)，因此本文應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)工程菌發(fā)酵產(chǎn)PPM的條件進(jìn)行優(yōu)化。本文的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　1.以海棲

3、熱袍菌（Thermotoga maritima）基因組為模板，根據(jù)內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶、阿拉伯內(nèi)切-1，4-β-半乳聚糖酶、磷酸戊糖變位酶三種嗜熱酶基因序列設(shè)計(jì)引物，質(zhì)粒pET-32a(+)為表達(dá)載體，E.coli BL21(DE3)為表達(dá)菌株，成功構(gòu)建表達(dá)海棲熱袍菌嗜熱酶的三種工程菌。
　　2.研究三種工程菌的生長(zhǎng)曲線，以IPTG為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白免疫印跡等方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示內(nèi)切-1,4

4、-β-葡聚糖酶、阿拉伯內(nèi)切-1，4-β-半乳聚糖酶未在工程菌中成功表達(dá)，磷酸戊糖變位酶成功表達(dá)。
　　3.運(yùn)用生物信息學(xué)軟件，對(duì)成功表達(dá)的目的蛋白酶理化性質(zhì)進(jìn)行分析；采用Ni-NTA樹(shù)脂層析柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果顯示可以得到電泳純的磷酸戊糖變位酶。
　　4.通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)構(gòu)建回歸方程對(duì)磷酸戊糖變位酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，最佳發(fā)酵條件為誘導(dǎo)種齡OD