超嗜熱古菌Pyrococcus horikoshii OT3幾丁質(zhì)代謝途徑及相關(guān)嗜熱酶系的研究.pdf

1、幾丁質(zhì)是自然界第二大類有機物質(zhì)，其降解是自然界中營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)利用的重要過程。通過對極端嗜熱球古菌pyrococcus horikoshii OT3基因組序列分析，該古菌可能存在一條新穎的幾丁質(zhì)降解途徑。通過鑒定該古菌中與幾丁質(zhì)代謝相關(guān)的保守ORF簇編碼蛋白的生化性質(zhì)，不但能夠鑒定該古菌特有的幾丁質(zhì)代謝途徑以及相關(guān)蛋白(嗜熱酶)協(xié)同作用降解幾丁質(zhì)的機理，而且能夠在詳細研究各種嗜熱酶催化特性、熱穩(wěn)定機制、催化機制的基礎(chǔ)上，開發(fā)在生物工程領(lǐng)域

2、具有應(yīng)用價值的極端酶類。本論文研究主要有以下幾個部分： 1.極端嗜熱球古菌pyrococcus horikoshii幾丁質(zhì)代謝途徑的研究采用PCR方法從pyrococcus horikkoshii OT3基因組中克隆出PH0511(外切氨基葡萄糖苷酶)、PH0499(幾丁二脫乙酰酶)、PH0495(甘油酸激酶)基因，插入到pET15b表達質(zhì)粒中，再進行E.coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL表達，并通過親和層

3、析及離子交換層析對重組蛋白進行純化。利用分子篩、薄層層析、熒光掃描和放射性磷標記等技術(shù)對嗜熱酶的催化特性以及生化性質(zhì)進行了詳細的研究。 通過對幾丁質(zhì)代謝相關(guān)嗜熱酶類性質(zhì)鑒定，推測在極端嗜熱球古菌P.horikoshii 0T3中存在著特有的幾丁質(zhì)代謝途徑。其主要特征是幾丁二脫乙酰酶Dac<,ph>(PH0499)能夠?qū)锥」烟?GlcNA<,n>)或幾丁二糖(GlcNAc<,2>)先脫去乙?；?，生成非還原性末端部分脫乙?；膸锥?/p>

4、寡糖或GlcN-GlcNAc，然后在外切氨基糖苷酶的水解作用下生成GlcNAc<,n-1>與GlcN，隨后DaC<,ph>將GlcNAc<,n-1>再脫去乙?；?，并在外切氨基葡萄糖苷酶的上述配合作用下，從而最終將幾丁寡糖降解為產(chǎn)物氨基葡萄糖。 雖然P.horikoshii缺少典型的幾丁質(zhì)酶，但在外切氨基葡萄糖苷酶和脫乙酰酶以及體內(nèi)其他糖苷水解酶(如甘露糖苷酶，PH0501)的共同作用下，能夠?qū)⑵浜５咨瞽h(huán)境中的幾丁類雜多糖降解為

5、氨基葡萄糖，從而進入下一步代謝途徑。甘油酸激酶的作用可能是參與糖酵解過程中古菌特有的非磷酸化的ED途徑。 2．極端嗜熱球古菌Pyrococcus horikoshii OT3 幾丁質(zhì)代謝相關(guān)嗜熱酶的表達及性質(zhì)研究 3.幾丁質(zhì)代謝相關(guān)嗜熱酶的應(yīng)用研究通過對幾丁質(zhì)代謝相關(guān)的嗜熱酶的性質(zhì)研究，探討了其在生物催化與生物降解領(lǐng)域的應(yīng)用。幾丁質(zhì)內(nèi)切酶與外切酶在食品領(lǐng)域?qū)τ谔烊粠锥≠|(zhì)類物質(zhì)的降解、生產(chǎn)幾丁寡糖等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。