嗜熱菌蛋白酶降解家蠶血清蛋白的機(jī)理研究.pdf

1、嗜熱菌蛋白酶(Thermolysin)是一種由病原微生物分泌的金屬蛋白酶,它需要一個(gè)鋅離子來維持其活性,四個(gè)鈣離子來維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。嗜熱菌蛋白酶屬于金屬蛋白酶M4家族中的一種,在很多動(dòng)物致病菌和真菌中發(fā)現(xiàn)了這一家族的酶。因?yàn)樗軌蚣羟屑闹黧w內(nèi)一些重要的蛋白而具有重要的毒力作用。對嗜熱菌蛋白酶的研究到目前為止都是用純化的蛋白在體外和該酶作用來了解它的毒力作用。本文中,我們以家蠶做為模式生物來研究它在一個(gè)復(fù)雜的生物背景中的作用方式。研究

2、結(jié)果如下:
　　1.對家蠶幼蟲注射嗜熱菌蛋白酶會(huì)造成它們的死亡。對V-1的家蠶幼蟲注射嗜熱菌蛋白酶或胰蛋白酶。注射嗜熱菌蛋白酶后的家蠶,血液不停的流出,且發(fā)生黑化現(xiàn)象,可能是因?yàn)槠茐牧怂鼈兊哪到y(tǒng)。然而,注射胰蛋白酶后并不影響它們的凝血系統(tǒng)而且家蠶也不會(huì)黑化。
　　2.嗜熱菌蛋白酶可以剪切純化的rPPO1使其喪失活性。用嗜熱菌蛋白酶或胰蛋白酶與純化的rPPO1反應(yīng),沒有檢測到發(fā)現(xiàn)明顯的rPO1活性。用嗜熱菌蛋白酶或胰蛋白酶

3、與微球菌誘導(dǎo)后的家蠶血清孵育結(jié)果顯示,微球菌誘導(dǎo)后的家蠶血清沒有酚氧化酶活性,用胰蛋白酶處理后的血清也不能產(chǎn)生酚氧化酶活性。而用嗜熱菌蛋白酶處理后的家蠶血清可產(chǎn)生較高的酚氧化酶活性。這些數(shù)據(jù)表明,嗜熱菌蛋白酶可以激活血清中的原酚氧化酶,但是對純化的rPPO1卻沒有作用。這表明,嗜熱菌蛋白酶是通過增加絲氨酸蛋白酶的活性來激活原酚氧化酶的。
　　3.嗜熱菌蛋白酶不能直接激活絲氨酸蛋白酶。用胰蛋白酶處理α-胰凝乳蛋白酶原或α-胰凝乳蛋白

4、酶,有很高的α-胰凝乳蛋白酶活性。然而,用嗜熱菌蛋白酶處理α-胰凝乳蛋白酶原或α-胰凝乳蛋白酶并不能使其轉(zhuǎn)變成為有活性的α-胰凝乳蛋白酶。這表明嗜熱菌蛋白酶不可以切割α-胰凝乳蛋白酶原。用嗜熱菌蛋白酶與α-胰凝乳蛋白酶原反應(yīng)后,用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后考馬斯亮藍(lán)染色,顯示α-胰凝乳蛋白酶原仍保持活性狀態(tài)。然而,用胰蛋白酶處理α-胰凝乳蛋白酶原后,很大一部分條帶消失了。這更加說明嗜熱菌蛋白酶不可以剪切α-胰凝乳蛋白酶原。這表明嗜

5、熱菌蛋白酶不可以直接激活絲氨酸蛋白酶。
　　4.嗜熱菌蛋白酶對哺乳動(dòng)物血清的降解作用。在37°C和42°C下,嗜熱菌蛋白酶可以降解哺乳動(dòng)物血清如兔血清,人AB血清,胎牛血清和BALB/C鼠血清。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn),嗜熱菌蛋白酶的降解血清的作用在42°C時(shí)比在37°C時(shí)更加明顯,而相同酶活單位、相同劑量的胰蛋白酶對哺乳動(dòng)物血清蛋白沒有明顯的作用。由此可見,嗜熱菌蛋白酶對血清蛋白的降解是一個(gè)普遍的現(xiàn)象。
　　5.對嗜熱菌蛋白酶作用的擬