集胞藻藻膽蛋白降解的蛋白酶研究.pdf

1、在各種營(yíng)養(yǎng)缺乏的情況下，藻膽體的降解會(huì)引起藍(lán)藻細(xì)胞的顏色由正常的藍(lán)綠色轉(zhuǎn)變成黃綠色，這種現(xiàn)象被稱為“褪色”或“光漂白”。雖然已有研究表明NblA與藻膽體的降解密切相關(guān)，但是對(duì)于NblA引發(fā)藻膽體降解的詳細(xì)機(jī)制并不清楚。藻膽體的降解過程除了需要NblA的引發(fā)之外必定需要特異性降解藻膽體的蛋白酶。Deg家族蛋白酶（HhoA、HhoB、HtrA）和CtpA蛋白酶均是藍(lán)藻細(xì)胞中非常重要的蛋白酶，目前國(guó)際上對(duì)于這些蛋白酶與藻膽體降解機(jī)制之間的關(guān)系

2、尚不清楚，本論文通過體外蛋白酶活性試驗(yàn)和復(fù)合物試驗(yàn)，重點(diǎn)對(duì)Deg和CtpA蛋白酶與藻膽蛋白降解機(jī)制之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，具有重要的理論意義和創(chuàng)新價(jià)值。
　　文中首次對(duì)集胞藻Synechocystis sp. PCC6803中的Deg和CtpA蛋白酶進(jìn)行了克隆表達(dá)。在切除N端信號(hào)肽或跨膜結(jié)構(gòu)之后，攜帶組氨酸標(biāo)簽的成熟HhoA、HhoB、HtrA和CtpA融合蛋白在大腸桿菌中得以表達(dá)，利用鎳離子親和層析法獲得了提純后的蛋白酶。

3、　　分別采用酪蛋白、牛血清蛋白、體內(nèi)重組色素蛋白和天然藻藍(lán)蛋白作為底物進(jìn)行酶活性體外測(cè)試。結(jié)果表明HhoA和HtrA對(duì)酪蛋白、重組色素蛋白和天然藻藍(lán)蛋白均具有水解活性，這證實(shí)了HhoA和HtrA能夠體外降解藻膽蛋白，與藻膽體降解機(jī)制密切相關(guān)。HhoB對(duì)被測(cè)試的所有底物均沒有活性，顯示了其功能與HhoA和HtrA之間的差異，但并不能僅憑體外活性試驗(yàn)就完全排除HhoB在藻膽體降解過程中的作用。熒光定量PCR研究表明，缺氮培養(yǎng)后藻細(xì)胞中的hh

4、oB轉(zhuǎn)錄量劇增，明顯超過hhoA和htrA，這表明HhoB有可能在藻膽體降解機(jī)制中發(fā)揮作用，故推測(cè)其酶活性有可能需要某種未知的多肽或輔助因子的激活。CtpA對(duì)酪蛋白和重組色素蛋白顯示極低活性，但是對(duì)天然藻膽蛋白沒有降解作用，同時(shí)ctpA在缺氮不同時(shí)段相對(duì)表達(dá)量變化不顯著，故推測(cè)其與藻膽體的降解過程無關(guān)。
　　文中將集胞藻PCC6803中的兩個(gè)nblA基因以融合蛋白的方式在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)獲得NblA蛋白，同時(shí)利用大腸桿菌表達(dá)獲得

5、魚腥藻PCC7120中的NblB蛋白，研究了添加NblA、NblB、金屬離子Mg2+和Ca2+對(duì)蛋白酶活性的影響。結(jié)果顯示，NblA和NblB對(duì)蛋白酶活性無促進(jìn)作用，反而有抑制作用，這表明HhoA和HtrA在藻膽體降解過程中的水解作用是獨(dú)立于NblA和NblB的。研究結(jié)果還顯示兩種金屬離子對(duì)酶活性基本沒有影響，并無促進(jìn)作用。
　　通過體外復(fù)合物研究可以確認(rèn)HhoA、HhoB、HtrA和CtpA四種蛋白酶與CpcA、NblA和Nbl

6、B之間未能形成復(fù)合物，由此可以確認(rèn)，NblA造成的酶活性抑制來自NblA與藻膽蛋白亞基之間形成的復(fù)合物，并非其與蛋白酶之間形成的復(fù)合物。HhoA與缺氮培養(yǎng)藻上清中的藻膽蛋白也不能形成復(fù)合物，故推測(cè)在HhoA與藻膽蛋白的降解作用中必然存在某種輔助因子的作用，但是該輔助因子并非NblA和NblB。
　　最后通過熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)分析集胞藻中13個(gè)蛋白酶基因在缺氮培養(yǎng)不同時(shí)段表達(dá)量的變化，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)pepP與藻膽體降解的早期啟動(dòng)有

7、密切關(guān)系，hhoB、htrA、ftsH、sppA和hhoA這5個(gè)基因可能在藻膽體降解的中后期發(fā)揮作用，其余7個(gè)基因clpP、ape2、sll2008、ctpA、ymxG、gcP、clpB可能與藻膽體的降解過程無關(guān)。
　　本論文還包括另外兩個(gè)研究?jī)?nèi)容，一是對(duì)藍(lán)藻藻膽體核-膜連接蛋白ApcE缺失突變體的體外自催化重組研究，構(gòu)建魚腥藻Anabaena. sp PCC7120別藻藍(lán)蛋白ApcE(1-240)的一系列N端缺失突變體基因，在大

8、腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)，對(duì)脫輔基蛋白與藻藍(lán)膽素（PCB）的體外自催化重組進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：在含有4 mol/L尿素的磷酸鉀緩沖體系中，ApcE(25-240)脫輔基蛋白可與藻藍(lán)膽素體外重組實(shí)現(xiàn)共價(jià)連接，其余6個(gè)缺失突變體蛋白僅能與藻藍(lán)膽素進(jìn)行非共價(jià)連接，不能發(fā)生自催化重組。
　　二是集胞藻Synechocystis sp. PCC6803藻藍(lán)蛋白和變?cè)逅{(lán)蛋白各亞基的體內(nèi)生物合成研究，利用多質(zhì)粒組合進(jìn)行體內(nèi)重組，將apcA、apc