藻膽蛋白的雙水相綠色提取技術(shù)研究.pdf

1、藻膽蛋白是存在于紅藻、藍(lán)藻中的一種水溶性色素蛋白，其捕光天線結(jié)構(gòu)能夠使藻類的光合作用得以發(fā)生，可用于環(huán)境功能材料的研究。因此，藻膽蛋白的提取成為目前的研究方向，本課題旨在尋求一種高效快速、清潔環(huán)保的藻膽蛋白分離純化技術(shù)。雙水相體系具有分離條件溫和，質(zhì)量傳輸快，成本低，易操作，可調(diào)節(jié)等特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取體系相比較，雙水相萃取體系在生物物質(zhì)的分離中有獨(dú)到的優(yōu)越之處。采用雙水相萃取技術(shù)對(duì)藻膽蛋白進(jìn)行分離純化，可實(shí)現(xiàn)藻膽蛋白的綠色高效提

2、取，滿足本課題的目的和要求，具有重要的環(huán)境意義。
　　本論文以壇紫菜藻中的R-藻紅蛋白（R-PE）和鈍頂螺旋藻中的C-藻藍(lán)蛋白（C-PC）為研究對(duì)象，探討藻膽蛋白的細(xì)胞破碎提取方法和雙水相體系分離純化方法。
　　分別采用反復(fù)凍融法、液氮研磨法、細(xì)胞溶脹法、低濃度 CaCl2提取法、SDS溶液提取法、纖維素酶提取法、超聲波破碎法提取藻膽蛋白。研究結(jié)果表明，對(duì)于R-PE，反復(fù)凍融法的效果最佳：在-20℃和4℃之間，以0.01M磷

3、酸鹽緩沖液為溶劑，冷凍時(shí)間為2 h，反復(fù)凍融6次，得到較高純度0.63。對(duì)于C-PC，細(xì)胞溶脹法提取法效果最佳，采用蒸餾水4℃下提取120 h，C-PC純度可以達(dá)到0.57。
　　分析兩種藻類提取液的光譜特性，R-PE特征吸收峰位于560nm，室溫?zé)晒獍l(fā)射峰位于579nm；C-PC特征吸收峰位于620nm，室溫?zé)晒獍l(fā)射峰位于665nm；說(shuō)明實(shí)驗(yàn)得到的提取液中含有目標(biāo)蛋白，且具有一定的熒光性和生物活性。
　　采用PEG/硫酸銨

4、雙水相體系對(duì)藻膽蛋白進(jìn)行分離，并與傳統(tǒng)鹽析法的分離效果相比較。研究結(jié)果表明，傳統(tǒng)鹽析法在硫酸銨飽和度為45～55％時(shí)，分離 R-PE得到純度大于1.36，得率大于70%；在硫酸銨飽和度為40～45%時(shí)，分離C-PC得到純度大于0.80，得率大于40%；由于高鹽環(huán)境導(dǎo)致部分目標(biāo)蛋白變性而藻膽蛋白的得率較低。PEG/硫酸銨雙水相萃取法在 WPEG1000=10%，W(NH4)2SO4=15%時(shí)，得到最佳分離效果，R-PE純度達(dá)到0.91，回

5、收率98.5%；在 WPEG4000=10%，W(NH4)2SO4=12.6%，得到最佳分離效果，C-PC純度達(dá)到1.00，回收率97.2%。；PEG/硫酸銨雙水相萃取法具有實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便省時(shí)，回收率高，且 PEG對(duì)藻膽蛋白具有穩(wěn)定作用等特點(diǎn)，因此 PEG/硫酸銨雙水相萃取法較傳統(tǒng)鹽析法具有一定優(yōu)勢(shì)。
　　采用不同 PEG/磷酸鹽雙水相體系對(duì)藻膽蛋白進(jìn)行分離，以正交試驗(yàn)分析的方法考察 PEG分子量、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、磷酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及

6、體系 pH值對(duì)分離效果的影響，確定各因素的最優(yōu)水平及影響因素的主次順序，并比較 NaHP和KHP對(duì)雙水相體系分配的影響。研究結(jié)果表明，R-PE和C-PC在PEG2000/KHP雙水相體系中分離效果較好，在WPEG=14%，WKHP=18%，pH6.8時(shí)，R-PE分離效果最佳，純度達(dá)到1.07，回收率98.6%；在WPEG=12%，WKHP=20%，pH5.6時(shí)，C-PC分離效果最佳，純度達(dá)到1.16，回收率98.2%。
　　R-P