一株嗜熱芽孢桿菌脂肪酶基因的克隆表達以及重組酶酶學性質(zhì)和應(yīng)用的研究.pdf

1、通過PCR得到Geobacillus stearothermophilus JC脂肪酶基因lipjC的全長，測序發(fā)現(xiàn)該基因包含長為1251bp的開放閱讀框，編碼388個氨基酸殘基及一個由28個氨基酸組成的信號肽。將脂肪酶基因全長和編碼成熟肽的片段同時克隆到原核表達載體pET-28a（+），將轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）并在同樣的條件下誘導(dǎo)表達后發(fā)現(xiàn)包含成熟肽的重組菌的表達水平（52030U/L）明顯高于包含前體（12100U/L

2、）的重組菌，說明切除信號肽能顯著提高表達水平并獲得更多的可溶性蛋白。 重組菌體經(jīng)超聲破碎，含可溶性目的蛋白的上清液通過一步固定化金屬離子親和層析得到電泳單一條帶的純酶，比活為515.6 U/㎎，活力回收率為40.5％。純化的酶經(jīng)SDS-PAGE分析，表明其大小約為43kDa，符合預(yù)期計算值。 酶學性質(zhì)研究表明該重組脂肪酶反應(yīng)的最佳溫度為55℃，最佳pH為9.0。脂肪酶JC在許多抑制劑如EDTA、β-巰基乙醇、PMSF、D

3、TT中都能保持穩(wěn)定，Triton X-100對該酶有明顯的激活作用。在1mM的終濃度下，K+，Na+，Mg2+，Ca2+、Mn2+能激活該酶，而Fe2+，Zn2+，Cu2+對酶存在抑制作用。在有機溶劑如DMSO、乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮、丁酮、乙睛等存在下，脂肪酶的活力沒有顯著的下降，表明該脂肪酶具有較好的有機溶劑耐受性。 以重組脂肪酶JC為催化劑，進行外消旋乙酸苯乙酯的拆分研究。在25℃，R-苯乙醇轉(zhuǎn)化率達到92％左右，得到e