短短芽孢桿菌FM4B幾丁質(zhì)酶發(fā)酵、基因克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、幾丁質(zhì)酶能夠催化水解除纖維素以外的第二大多糖—幾丁質(zhì)中的β-1，4糖苷鍵，生成N-乙酰葡萄糖胺和殼寡糖。采用幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)是至今為止最環(huán)保高效的方法。同時(shí)幾丁質(zhì)酶可以殺滅病原真菌，在植物病蟲(chóng)害以及果蔬采后貯藏病害的生物防治中具有很大的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。
　　本課題首先研究短短芽孢桿菌FM4B幾丁質(zhì)酶的分離純化以其酶學(xué)性質(zhì)，菌株FM4B搖瓶發(fā)酵液經(jīng)過(guò)離心、醇沉及葡聚糖凝膠G-100層析純化，SDS-PAGE測(cè)定其分子量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得

2、幾丁質(zhì)酶純品，酶的純化倍數(shù)為7.19，酶活回收率為30.6％，分子量為66 kDa;酶活力在pH5.0～9.0范圍內(nèi)和80℃以下穩(wěn)定，最適pH值為6.0，最適溫度為50℃;0.001mol/L的Cu2+，Hg2+，Pb2+，Co2+以及Zn2+對(duì)該酶有強(qiáng)烈的抑制作用，Mg2+和Ca2+對(duì)該酶的活力具有一定的促進(jìn)作用;該酶對(duì)多種霉菌有顯著的抑菌效果且穩(wěn)定性好。
　　在上述研究的基礎(chǔ)上，本課題研究了該幾丁質(zhì)酶的發(fā)酵工藝。結(jié)果表明其最優(yōu)

3、發(fā)酵條件為:膠體幾丁質(zhì)為最適碳源，蛋白胨為最適氮源，它們的最適含量均為1％，4％的接種量，最初發(fā)酵培養(yǎng)基pH6.0以及50mL/(250mL三角瓶)的裝樣量，在28℃，210r/min轉(zhuǎn)速下發(fā)酵培養(yǎng)24h，產(chǎn)率最高，酶活力為312U/mL。
　　為更有效的獲得該幾丁質(zhì)酶，防治植物病原真菌，本研究第三部分對(duì)該幾丁質(zhì)酶進(jìn)行分子生物學(xué)研究，構(gòu)建能高效表達(dá)幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)型工程菌株。并研究重組酶的酶學(xué)性質(zhì)及發(fā)酵條件優(yōu)化。通過(guò)genebank

4、同源性比對(duì)，設(shè)計(jì)引物，成功從菌株FM4B中調(diào)取該酶基因，通過(guò)PET-22b質(zhì)粒將該基因轉(zhuǎn)入E.ColiBL21(DE3)中，在IPTG誘導(dǎo)的條件下，該酶得到大量表達(dá);該重組酶的最適反應(yīng)溫度、pH分別為50℃和6。在20℃-50℃，pH5.0-7.0具有較好的溫度與pH值穩(wěn)定性;0.001mol/L的CaCl2和MnCl2·4H2O的促進(jìn)和抑制作用最強(qiáng);以膠體幾丁質(zhì)為底物的Km值為2.830mg/mL和Vmax值為5.35 mg/mL·m