短短芽孢桿菌FM4B幾丁質酶發(fā)酵、基因克隆表達及酶學性質研究.pdf

1、幾丁質酶能夠催化水解除纖維素以外的第二大多糖—幾丁質中的β-1，4糖苷鍵，生成N-乙酰葡萄糖胺和殼寡糖。采用幾丁質酶降解幾丁質是至今為止最環(huán)保高效的方法。同時幾丁質酶可以殺滅病原真菌，在植物病蟲害以及果蔬采后貯藏病害的生物防治中具有很大的應用開發(fā)前景。
　　本課題首先研究短短芽孢桿菌FM4B幾丁質酶的分離純化以其酶學性質，菌株FM4B搖瓶發(fā)酵液經(jīng)過離心、醇沉及葡聚糖凝膠G-100層析純化，SDS-PAGE測定其分子量。實驗結果獲得

2、幾丁質酶純品，酶的純化倍數(shù)為7.19，酶活回收率為30.6％，分子量為66 kDa;酶活力在pH5.0～9.0范圍內和80℃以下穩(wěn)定，最適pH值為6.0，最適溫度為50℃;0.001mol/L的Cu2+，Hg2+，Pb2+，Co2+以及Zn2+對該酶有強烈的抑制作用，Mg2+和Ca2+對該酶的活力具有一定的促進作用;該酶對多種霉菌有顯著的抑菌效果且穩(wěn)定性好。
　　在上述研究的基礎上，本課題研究了該幾丁質酶的發(fā)酵工藝。結果表明其最優(yōu)

3、發(fā)酵條件為:膠體幾丁質為最適碳源，蛋白胨為最適氮源，它們的最適含量均為1％，4％的接種量，最初發(fā)酵培養(yǎng)基pH6.0以及50mL/(250mL三角瓶)的裝樣量，在28℃，210r/min轉速下發(fā)酵培養(yǎng)24h，產率最高，酶活力為312U/mL。
　　為更有效的獲得該幾丁質酶，防治植物病原真菌，本研究第三部分對該幾丁質酶進行分子生物學研究，構建能高效表達幾丁質酶的誘導型工程菌株。并研究重組酶的酶學性質及發(fā)酵條件優(yōu)化。通過genebank

4、同源性比對，設計引物，成功從菌株FM4B中調取該酶基因，通過PET-22b質粒將該基因轉入E.ColiBL21(DE3)中，在IPTG誘導的條件下，該酶得到大量表達;該重組酶的最適反應溫度、pH分別為50℃和6。在20℃-50℃，pH5.0-7.0具有較好的溫度與pH值穩(wěn)定性;0.001mol/L的CaCl2和MnCl2·4H2O的促進和抑制作用最強;以膠體幾丁質為底物的Km值為2.830mg/mL和Vmax值為5.35 mg/mL·m