植酸酶appA基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析.pdf

1、植酸是植物性飼料中磷的主要存在形式，在谷物和豆類中其含量超過(guò)總磷的80％，磷是動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的重要元素之一。植酸酶是一種能夠水解植酸并釋放無(wú)機(jī)磷的磷酸酶類，廣泛存在于植物及微生物中，它作為單胃動(dòng)物的飼料添加劑已得到了世界范圍內(nèi)的廣泛認(rèn)可。單胃動(dòng)物的胃、腸道環(huán)境中因缺乏植酸酶或植酸酶活性很低導(dǎo)致不能分解植酸而釋放其中的無(wú)機(jī)磷，植酸能夠螯合植物營(yíng)養(yǎng)因子降低其利用率，導(dǎo)致必須向飼料中添加營(yíng)養(yǎng)因子以滿足其生長(zhǎng)發(fā)育的需要，從而造成成本增高

2、和帶來(lái)環(huán)境污染等影響。通過(guò)向動(dòng)物飼料中添加植酸酶就可以緩解這一問(wèn)題。
　　 來(lái)自于大腸桿菌的appA植酸酶是一種新型的植酸酶，它在單胃動(dòng)物胃腸道的酸性環(huán)境中適應(yīng)能力和分解植酸的能力都很強(qiáng)，而且，appA植酸酶還是目前已知的活性最強(qiáng)的植酸酶。
　　 本研究采用維生素C-鉬藍(lán)法從飼喂青飼料的豬糞便中篩選到一株高產(chǎn)appA植酸酶活性的大腸桿菌菌株，并根據(jù)已報(bào)道的基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特征性PCR引物，克隆到了該植酸酶appA基因。D

3、NA測(cè)序結(jié)果表明，本研究所克隆到的植酸酶基因片段與已報(bào)道的appA植酸酶基因具有較高的同源性，該植酸酶appA基因閱讀框大小為1233 bp，編碼411個(gè)氨基酸，其表達(dá)產(chǎn)物理論分子質(zhì)量(MW)和等電點(diǎn)(pI)分別為44.821 kDa和6.09，(G+C)％含量為54.60％。氨基酸結(jié)構(gòu)分析表明該appA植酸酶具有與酸性磷酸酶相同的活性保守基序RHGxRxP和催化活性中心HD，并且存在有3個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)。
　　 為獲得大量

4、的appA植酸酶，我們將appA基因克隆到甲醇營(yíng)養(yǎng)型巴斯德畢赤酵母GS115中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)PCR陽(yáng)性鑒定和酶活性測(cè)定，篩選到了一株能夠表達(dá)較高酶活性的appA植酸酶基因工程菌GS115/appA，通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，得到一條約55～60 kDa的特征條帶。表達(dá)蛋白經(jīng)Ni親和柱純化，其appA植酸酶比活力為2669.46U/mg，分子量約57.2 kDa。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，重組appA植酸酶的最適溫度和最適pH分