木霉菌Tr31幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)及其基因克隆研究.pdf

1、幾丁質(zhì)酶普遍存在于各種動(dòng)物、植物和微生物中,在醫(yī)藥、食品、環(huán)保、生防等許多領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)篩選出多種幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌,并將其進(jìn)行分離純化。但只有部分在實(shí)際中得到應(yīng)用,主要原因是菌株的產(chǎn)酶能力較低。因此篩選出產(chǎn)酶活力高、穩(wěn)定的菌株是解決問(wèn)題的一條重要途徑。木霉菌作為一種生防菌,在生物防治中占有極其重要的地位,在其重寄生過(guò)程中產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶能夠降解多種病原菌細(xì)胞壁。
　　 本文從木霉菌Tr31產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的確定、菌種

2、的鑒定、幾丁質(zhì)酶的分離和酶學(xué)性質(zhì)研究以及幾丁質(zhì)酶基因的克隆等幾個(gè)方面進(jìn)行了研究,結(jié)果如下:
　　 通過(guò)透明圈法和DNS法來(lái)確定木霉菌Tr31是否產(chǎn)幾丁質(zhì)酶,結(jié)果發(fā)現(xiàn):木霉菌Tr31在以膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源的平板上生長(zhǎng),并沒(méi)有透明圈的出現(xiàn)。通過(guò)DNS法檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),發(fā)酵液變成了棕紅色,說(shuō)明菌株能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。
　　 在幾丁質(zhì)酶純化過(guò)程中,首先對(duì)10000NMWC、50000NMWC、100000NMWC型號(hào)的超濾膜進(jìn)行篩選,

3、最終確定10000NMWC的超濾膜為最佳型號(hào)。通過(guò)硫酸銨沉淀試驗(yàn),以沉淀比活力最大為依據(jù),確定硫酸銨飽和度90％為最佳濃度。菌株發(fā)酵液經(jīng)超濾、(NH4)2SO4沉淀,沉淀物經(jīng)脫鹽后得到粗酶液。將粗酶液進(jìn)行SephadexG-100柱層析,分離出2個(gè)蛋白峰,其中僅峰2具幾丁質(zhì)酶活性。收集幾丁質(zhì)酶蛋白,對(duì)其進(jìn)行SDS-PAGE電泳,得出該蛋白的分子量約為46kDa。該幾丁質(zhì)酶最適反應(yīng)溫度是50℃,最適反應(yīng)pH值為5.0。幾丁質(zhì)酶的穩(wěn)定性測(cè)定

4、結(jié)果表明,酶液在30℃以下溫度處理1h,酶性質(zhì)穩(wěn)定;在pH4-7條件下處理1h,活性基本不變。Ca2+、Mg2+、Ba2+等金屬離子對(duì)酶活力有明顯的激活作用,而Cu2+、Fe3+、Zn2+等對(duì)該酶有明顯的抑制作用。
　　 采用培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征觀察法對(duì)木霉菌Tr31進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)該菌株與棘孢木霉的形態(tài)特征非常相似;進(jìn)一步對(duì)該菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行克隆并測(cè)序,發(fā)現(xiàn)該菌株的ITS序列與GenBank中已報(bào)道的棘孢木霉的ITS

5、序列的同源性高達(dá)100％,證實(shí)該菌株為棘孢木霉Trichodermaasperellum。
　　 根據(jù)幾丁質(zhì)酶基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物、再根據(jù)克隆到的幾丁質(zhì)酶基因片段序列設(shè)計(jì)特異性引物,運(yùn)用RT-PCR、RACE-PCR、TAIL-PCR技術(shù),從木霉菌Tr31中克隆出完整的幾丁質(zhì)酶基因。該基因cDNA全長(zhǎng)1465bp,閱讀框架（ORF）位于61～1335位核苷酸之間,編碼424個(gè)氨基酸,信號(hào)肽長(zhǎng)度為22個(gè)氨基酸。全長(zhǎng)DNA序列