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文檔簡介
1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一種昆蟲病原微生物,因其產生殺蟲晶體蛋白而被開發(fā)為最成功的細菌殺蟲劑。幾丁質酶基因在Bt中廣泛分布,迄今已從Bt不同亞種的菌株中克隆出多種幾丁質酶基因,并進行了初步酶活性和防病抗蟲等方面的研究。近幾年來,關于幾丁質酶在蘇云金芽胞桿菌中的分布、產酶的條件、幾丁質酶的性質與結構、幾丁質酶基因的克隆、以及幾丁質酶在生物防治中的作用等方面的研究逐漸增加。開展幾丁質酶的研究,對
2、幾丁質資源的轉化,已成為全球性熱門科研課題。
本文通過透明圈法從土壤中,篩選出一株產幾丁質酶的菌株BtDLD171。DNS比色法測定菌株的酶活力,發(fā)現(xiàn)并無明顯顏色變化。根據已知Bt幾丁質酶基因序列設計全長引物,克隆得到BtDLD171的幾丁質酶的基因序列,并在大腸桿菌Rosetta(DE3)中表達。Bt DLD171的chiA73基因編碼一個分子量為67kDa的蛋白,該蛋白具有一個由催化區(qū)域和幾丁質結合區(qū)域組成的模塊結構。用不
3、同的熒光底物研究幾丁質酶活性,發(fā)現(xiàn)原菌發(fā)酵液既能水解4-MU-(GlcNAc)3,也可水解4-MU-GlcNAc,而表達的ChiA73只能水解4-MU-(GlcNAc)3,表明ChiA73為內切幾丁質酶。在pH4-10之間,該酶均具有水解酶的活性,在pH8時,活性最高。幾丁質酶ChiA73的最適溫度為40℃。
本文采用透明圈方法,從40份土壤中篩選到4株產幾丁質酶的非Bt菌株。DNS方法測定四株幾丁質酶活性,最高的幾丁質酶酶活
4、性為132 U/ml。將該菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)2-3d后,菌落小、呈白色、表面光滑、邊緣整齊、微突起、似細菌菌落、但是不透明。經16S rRNA序列鑒定后表明:該菌為東方擬無枝酸菌,屬于稀有放線菌屬,命名為Amycolatopsis orientalis YM9-2。根據已知東方擬無枝酸菌HCCB10007全基因組序列中的幾丁質酶基因序列,設計兩對PCR引物,對該菌株進行幾丁質酶基因的克隆??寺〉玫揭粋€大小約1 kb
5、的DNA序列和一個大小約1.6 kb的DNA序列,測序結果表明兩個序列均為幾丁質酶基因。其中一個幾丁質酶基因(GenBank登錄號為KP338820)的全長序列為1056bp,編碼351個氨基酸,預測其分子量為36.9 kDa,等電點為8.26。另一個幾丁質酶基因(GenBank登錄號為KP338819)的全長序列為1638 bp,編碼545個氨基酸,預測其分子量為57.1 kDa,等電點為7.98。對Amycolatopsis ori
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