產(chǎn)芳基硫酸酯酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、芳基硫酸酯酶(Arylsulfatase)是一種催化裂解硫酸酯鍵,生成相應(yīng)的醇和無(wú)機(jī)硫酸根的酶,該酶可以脫除瓊膠分子中的硫酸根,進(jìn)而可以替代對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重、產(chǎn)品得率低的化學(xué)方法,用于制備高品質(zhì)的瓊脂糖。本文以對(duì)硝基苯酚硫酸酯鉀鹽(pNPS)為篩選底物,首次從青島海域紅藻中分離篩選出一株能高效分泌芳基硫酸酯酶的菌株。該菌株經(jīng)革蘭氏染色為陰性,需氧,彎桿狀,生理生化特征驗(yàn)證及16S rDNA序列分析確定為海單胞菌屬,并將其命名為Marino

2、monas sp. FW-1,簡(jiǎn)稱FW-1。
　　證實(shí)了菌株FW-1的產(chǎn)酶能力后,選取常用的pNPS法對(duì)其產(chǎn)酶能力進(jìn)行定量分析。采用單因素-響應(yīng)面方法對(duì)菌株 FW-1產(chǎn)芳基硫酸酯酶的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,其最佳培養(yǎng)基組分為(w/v):瓊脂0.2％,酵母膏0.2%,蛋白胨0.5%, NaCl2.89%, MgCl2·6H200.412%, KCl0.1%, CaCl20.02%,K2HPO4·3H200.013%,

3、FeCl2·4H2O0.002%,MnCl20.09%,焦磷酸鈉0.043%,吐溫-801.87%;最佳培養(yǎng)條件如下:初始 pH為7,培養(yǎng)溫度為35℃,發(fā)酵時(shí)間為72h,接種量為1%,250mL錐形瓶裝液量為50mL。在上述最佳培養(yǎng)基成分及最佳培養(yǎng)條件下,菌株 FW-1的產(chǎn)酶能力為1.07U/mL,酶活力相對(duì)于優(yōu)化前提高了4.28倍。
　　菌株 FW-1能夠穩(wěn)定地產(chǎn)生芳基硫酸酯酶,該酶主要位于菌體細(xì)胞內(nèi)部,在最適培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng)

4、72h后,發(fā)酵液經(jīng)低溫離心、超聲波細(xì)胞破碎、硫酸銨分級(jí)沉淀、透析除鹽、超濾濃縮、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳原位檢測(cè)及分離后得到粗酶液。純度鑒定及分子量測(cè)定表明該酶的分子量約為60kDa。酶學(xué)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)表明,芳基硫酸酯酶的最適反應(yīng)溫度和 pH分別是45℃和11。該酶在4℃以下保存時(shí)較為穩(wěn)定,在4℃放置72h后,酶活仍保留在95%以上,酶的熱穩(wěn)定良好,25℃保溫48h后,酶活剩余90%左右,但當(dāng)溫度大于35℃時(shí),6h以后酶活就開(kāi)始急劇下降。該酶

5、在 pH為7.0~11.0時(shí)具有良好的穩(wěn)定性。當(dāng)金屬離子濃度為0.1mM/L時(shí),K+、Ba2+和 Ca2+對(duì)芳基硫酸酯酶酶活力具有顯著的促進(jìn)作用, Hg2+能夠抑制芳基硫酸酯酶酶活力,酶活下降了59%;當(dāng)離子濃度為1mM/L時(shí),Ba2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+及 Ca2+對(duì)芳基硫酸酯酶酶活力具有顯著的促進(jìn)作用, Hg2+同樣能夠有效地抑制芳基硫酸酯酶酶活力,酶活大幅度下降了80%。利用純化后的芳基硫酸酯酶對(duì)瓊膠進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn),結(jié)果表