17650.產(chǎn)瓊脂酶菌株的篩選、產(chǎn)酶條件及酶學性質(zhì)的研究

1、蘇州大學學位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學位論文是本人在導師的指導下j獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得蘇州大學或其它教育機構(gòu)的學位證書而使用過的材料。對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人承擔本聲明的法律責任。論文作者簽名：一：圣經(jīng)璽日期：摯12爭’7產(chǎn)瓊脂酶菌株的篩選、產(chǎn)酶條件及酶學性質(zhì)的研究中文摘要中文摘要

2、中又捅要瓊脂酶在海藻的單細胞分離、原生質(zhì)體制備以及具有生理功能活性的海藻寡糖的酶法生產(chǎn)和結(jié)構(gòu)研究中具有重要使用價值。目前研究的瓊脂酶主要由海洋細菌產(chǎn)生。不同的廢水中含有大量化合物，擁有豐富的微生物資源。本文從印染廢水中分離到一株產(chǎn)瓊脂酶細菌Q5，經(jīng)伯杰氏菌種鑒定手冊和16SrDNA序列分析鑒定，將其歸屬于紅球菌屬(Rhodococcussp)，這是首次報道該屬菌的產(chǎn)瓊脂酶特性。對Q5的生長及產(chǎn)瓊脂酶條件進行初步優(yōu)化。結(jié)果表明，Q5在培養(yǎng)

3、基初始pH值40～90、溫度15。C一35。C、NaCl濃度0％5％條件下能生長。Q5所產(chǎn)的瓊脂酶為誘導酶，實驗中除乳糖之外的糖對其產(chǎn)酶起抑制作用。Q5能利用淀粉，不能利用纖維素、羧甲基纖維素(CMC)。當乳糖或淀粉作為唯一碳源、能源時，培養(yǎng)基中也能檢測到瓊脂酶活性。Q5具有自生固氮作用，能在不含氮源的培養(yǎng)基中生長。有機氮源比無機氮源更有利于Q5生長、產(chǎn)酶，且較低濃度的有機氮源(蛋白胨)更有利于產(chǎn)酶。Q5的最佳生長及產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)基初

4、始pH60、溫度30。C、接種量1％、250mL的搖瓶裝液量50mL、搖床轉(zhuǎn)速140r／min、NaCl1％、瓊脂05％、乳糖01％、蛋白胨O05％，培養(yǎng)36h后發(fā)酵液中酶活達到最高，為0254U／mL。Q5所產(chǎn)瓊脂酶是一種誘導型的胞外酶，發(fā)酵液經(jīng)低溫離心、硫酸銨鹽析、透析、濃縮后得到瓊脂酶粗酶。將粗酶進行nativePAGE(非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)、酶活性染色，確定了該菌株發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白中只有一個具有瓊脂酶活力的組分。切割具酶活性

5、的PAGE片段搗碎后溶解于PBS緩沖液(20mmol／L、pH701中過夜，離心后得到的上清液作為純的瓊脂酶液，再次進行nativePAGE、酶活性染色得到驗證。酶的性質(zhì)研究表明，瓊脂酶的相對分子量為54kDa；其最適反應溫度、pH分別為40。C、60，酶活力在40℃以下及pH5080范圍內(nèi)相對穩(wěn)定；酶反應的最適瓊脂底物濃度為O7％；Na、K、Ca2對其酶活力無影響，而試驗中其它重金屬離子及SDS、EDTA則抑制其活性；瓊脂酶的Km和V