產(chǎn)瓊膠酶菌株的篩選及其酶學(xué)性質(zhì).pdf

1、本文從廈門近海海域水樣中篩選分離得到一株高產(chǎn)瓊膠酶能力的菌株，并進(jìn)行菌株鑒定，發(fā)酵工藝參數(shù)和酶解條件優(yōu)化，通過(guò)薄層色譜層析和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析鑒定酶解產(chǎn)物組成，并對(duì)酶解產(chǎn)物的生物活性進(jìn)行探究，分述如下：
　　1)分離獲得8株具有瓊膠降解活性的菌株，其中fst-13007酶活力最高（保藏編號(hào)CCTCC NO:M2013708），對(duì)其16S rDNA經(jīng)過(guò)BLAST序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)分析，鑒定為海旋菌（Thalassospi

2、ra）屬，將其命名為Thalassospira sp.fst-13007。
　　2)通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)獲得菌株fst-13007的搖床-三角瓶環(huán)境的適宜發(fā)酵條件為：溫度35℃、三角瓶裝液量70 ml/250 ml、搖床轉(zhuǎn)速200 rpm、NaCl濃度3％、初始pH8.0、接種量8%、瓊脂粉濃度0.8%、蛋白胨+酵母粉（0.5+0.1）%（w/v）。在此發(fā)酵條件下，酶活達(dá)到最大2.76 U/ml，是未優(yōu)化時(shí)的3.4倍。
　　3)對(duì)f

3、st-13007所產(chǎn)的瓊膠酶通過(guò)一系列手段進(jìn)行分離純化，包括硫酸銨分級(jí)鹽析，切向超濾過(guò)濾，DEAE-Sepharose Fast Flow柱進(jìn)行離子交換層析與和 Sephcryl S-100進(jìn)行凝膠色譜柱層析，獲得純的瓊膠酶，純化倍數(shù)18.97，收率13.87％，比活力1418U/mg，相對(duì)分子量約66.2 KDa。
　　4)對(duì)瓊膠酶aga-fst的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明：底物濃度為0.5%，最適反應(yīng)溫度為45℃，最適pH為8；在2

4、0-50℃和pH4-8具有較穩(wěn)定的酶活。Cu2+，F(xiàn)e3+對(duì)該瓊膠酶有強(qiáng)抑制，Mn2+，DTT有促進(jìn)酶活力提高的作用；Ca2+、Na+、Mg2+、K+、SDS和EDTA對(duì)酶活均有一定的抑制作用。
　　5)通過(guò)蛋白質(zhì)譜MALDI-TOF-TOF分析表明瓊膠酶aga-fst與β-瓊膠酶（AAA91888）具有顯著的同源性。可初步推測(cè)瓊膠酶aga-fst為一種新型的GH16超級(jí)水解家族的β-瓊膠酶。通過(guò)對(duì)底物特異性的實(shí)驗(yàn)后證明瓊膠酶ag