幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及幾丁質(zhì)裂解酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、幾丁質(zhì)(chitin)是由N-乙酰氨基葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵聚合而成的直鏈大分子，是大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的組成成分，也廣泛存在于甲殼類動(dòng)物和昆蟲的外殼以及昆蟲的中腸圍食膜中。幾丁質(zhì)酶作為幾丁質(zhì)這一主要生物多聚物的降解酶類，以其兼具抑制病原真菌生長(zhǎng)和殺滅害蟲的雙重作用，且對(duì)動(dòng)植物、人體無(wú)害，不污染環(huán)境的優(yōu)勢(shì)，而在植物病蟲害無(wú)公害防治方面極有研究和利用價(jià)值，本文針對(duì)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的篩選、抗病測(cè)試、分類鑒定、基因克隆表達(dá)等方面進(jìn)行了研究，結(jié)果

2、如下。 1.幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的分離篩選。利用平板稀釋分離法從土壤中分離到132株細(xì)菌和放線菌，用平板透明圈法篩選到32株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株，其中細(xì)菌20株，放線菌12株。幾丁質(zhì)酶活性較強(qiáng)的有編號(hào)為P6、C-10、9、F2、J4、J7、4-2、X菌株。活性最強(qiáng)的為F2菌株，其透明圈與菌落直徑比為3.14。對(duì)水稻紋枯病菌拮抗作用最強(qiáng)的細(xì)菌是C-10菌株，放線菌是P6菌株，抑菌帶分別為7mm和12mm。通過(guò)幾丁質(zhì)酶活性和抑菌活性強(qiáng)弱確定優(yōu)勢(shì)

3、拮抗菌株為P6、C-10和F2菌株。經(jīng)形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、細(xì)胞壁化學(xué)組分分析和生理生化分析，P6、C-10和F2菌株分別鑒定為球孢鏈霉菌(Streptomycesglobisporus)，短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，淺黃金桿菌(Aureobacteriumflavesnes)。這3個(gè)菌株均為新的幾丁質(zhì)裂解菌。 2.菌株對(duì)病原菌的拮抗試驗(yàn)。以稻瘟病菌Magnaporthegrisea，水稻紋枯病菌Rhizoct

4、oniasolani頭孢霉Cephalosporiumsp.，小麥赤霉病菌Gibberellazeae，黃瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum，禾谷類鐮刀菌Fusariumgraminearum，西瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.niveum，茄子枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.Melongenae，辣椒炭疽病菌Colletotrichumgloeospo

5、rioides，馬尾菇枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.Coprinuscomatus，長(zhǎng)蠕孢霉Helminthosporinm.sp11種病原真菌為指示菌，應(yīng)用平皿拮抗法測(cè)定P6、F2、C-10菌株抑菌作用，顯示這3個(gè)菌株對(duì)大多數(shù)病原真菌具不同程度的抑制作用，其中P6菌株對(duì)水稻紋枯病菌Rhizoctoniasolani和辣椒炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides的抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶均為1

6、2mm；C-10菌株對(duì)長(zhǎng)蠕孢霉Helminthosporinm.sp的抑菌帶為10mm。 3.幾丁質(zhì)酶蛋白對(duì)病原菌的拮抗試驗(yàn)。以辣椒炭疽病菌、水稻紋枯病菌、稻瘟病菌和黃瓜枯萎病菌4種病原真菌為病原指示菌，提取菌株P(guān)6、F2、C-10的粗蛋白做平皿抑菌測(cè)試，顯示P6、F2、C-10菌株粗蛋白對(duì)4種病原真菌均具拮抗活性，其中P6菌株對(duì)水稻紋枯病菌、辣椒炭疽病菌2種病原菌的拮抗活性較強(qiáng)，抑菌帶分別為7mm和6mm。 4.幾丁質(zhì)

7、酶基因克隆研究。通過(guò)建立DNA文庫(kù)的方法對(duì)C-10菌株進(jìn)行了幾丁質(zhì)酶基因克隆研究。提取C-10菌株DNA，經(jīng)Sau3AI部分酶切后分離2-10kb的片段，插入PUC19的BamHI位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coliDH5a)，在幾丁質(zhì)平板上篩選陽(yáng)性克隆。從菌株C-10的重組子中篩選到一個(gè)產(chǎn)透明圈的陽(yáng)性克隆(命名為DHu)，提取其質(zhì)粒(質(zhì)粒命名為PUC-U)酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)該克隆插入片段大約2k，對(duì)該片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明該片段長(zhǎng)為1637b

8、p，該序列命名為D1637。另外對(duì)P6和F2菌株也進(jìn)行了幾丁質(zhì)酶基因克隆研究，從兩個(gè)菌株的大約5400個(gè)重組子中沒(méi)篩選到能產(chǎn)生水解圈的陽(yáng)性克隆，估計(jì)是重組子數(shù)量不夠。 5.生物信息學(xué)研究。對(duì)D1637序列通過(guò)softberry分析結(jié)果表明，該序列預(yù)測(cè)一個(gè)基因，其CDS長(zhǎng)為1176bp，編碼391個(gè)aa，將這一基因命名為ChiMC基因。利用DNAstar和predictprotein對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其一級(jí)序列包括33個(gè)堿性a

9、a，45個(gè)酸性，156個(gè)疏水a(chǎn)a，92個(gè)極性aa。利用softberry對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)包含17個(gè)a螺旋，10個(gè)β折疊。通過(guò)Swiss預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白含有三個(gè)明顯結(jié)構(gòu)域，中央結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)鋅原子。 Ncbi-Blastn序列比對(duì)顯示有1216bp的一段區(qū)域與來(lái)自E.coli菌株的一段基因組DNA同源，其中與EscherichiacoliK-12MG1655菌株的基因組DNA同源性最高，達(dá)

10、100％。該菌株的這段序列為編碼磷酸甘露糖異構(gòu)酶(phosphomannoseisomerase,PMI)的manAgene的編碼區(qū)。另一段350bp的序列與Cestrumyellowleafcurlingvirus(CmYLCV)的基因組DNA同源，同源性高達(dá)100％，該文獻(xiàn)對(duì)這段序列未做注釋。在以上2段區(qū)域之間以及D1637序列的一端分別有56bp和17bp的空白區(qū)域，在GeneBank里找不到同源序列。說(shuō)明C-10菌株基因組DNA

11、的這段序列尚未在GeneBank里登錄。通過(guò)softberry對(duì)D1637序列進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示在CmYLCV序列區(qū)域內(nèi)預(yù)測(cè)一個(gè)啟動(dòng)子。利用Expasy軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)含有5個(gè)功能位點(diǎn)：N端?；稽c(diǎn)(N-myristoylationsite)、PKC磷酸化位點(diǎn)(ProteinkinaseCphosphorylattonsite)、酪蛋白激酶-Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(CaseinkinaseⅡphosphorylati

12、onsit)、酪氨酸硫酸化位點(diǎn)(Tyrosinesulfationsite)、微生物羧基端定位信號(hào)位點(diǎn)(MicrobodiesC-terminaltargetingsignal)。通過(guò)Ncbi-Blastp、Smart、InterProScan3個(gè)蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)軟件對(duì)該蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白具有一個(gè)保守PMItypeI域，PMI具有催化6-磷酸甘露糖和6-磷酸果糖間異構(gòu)互換的功能。 6.PET-ChiMC原核表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)

13、化表達(dá)。將ChiMC基因的CDS區(qū)插入PET-30a(+)表達(dá)載體，構(gòu)建了PET-ChiMC原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)1～3h后，SDS-PAGE顯示表達(dá)了大量目的蛋白。將表達(dá)產(chǎn)物點(diǎn)到幾丁質(zhì)平板上，培養(yǎng)3d后未出現(xiàn)透明圈，據(jù)此初步認(rèn)為PMI本身不能降解幾丁質(zhì)。本試驗(yàn)中克隆到的基因不同于一般的幾丁質(zhì)酶基因，結(jié)構(gòu)上與大多數(shù)幾丁質(zhì)酶基因沒(méi)有同源性，可能是一種獨(dú)特的幾丁質(zhì)酶基因。 7.基因功能驗(yàn)證。將重組大腸

14、桿菌DHu做平板抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明DHu菌株對(duì)小麥赤霉病病原菌有明顯抑制作用。其發(fā)酵液做室內(nèi)殺蟲試驗(yàn)結(jié)果顯示，能顯著提高Bt工程菌DHF10對(duì)菜青蟲的的殺蟲效率，使害蟲集中死亡時(shí)間提前大約30h，而菌株DHu發(fā)酵液?jiǎn)为?dú)對(duì)害蟲無(wú)殺滅效果。 8.幾丁質(zhì)酶蛋白的活性檢測(cè)。用幾丁質(zhì)誘導(dǎo)發(fā)酵P6、F2、C-10以及DHu菌株，發(fā)酵液應(yīng)用硫酸銨沉淀法提取粗蛋白，充分透析后在幾丁質(zhì)平板上呈現(xiàn)明顯透明圈，未經(jīng)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的P6、F2、C-10菌株