幾丁質(zhì)脫乙酰酶產(chǎn)生菌的篩選.pdf

1、幾丁質(zhì)脫乙酰酶(Chitin deacetylaSe,簡稱CDA)是能夠?qū)锥≠|(zhì)分子中的乙酰基直接脫除而生成殼聚糖的酶,而幾丁質(zhì)作為酶的底物,難溶于水,因此CDA酶活力的測定非常復(fù)雜和困難,使得CDA的相關(guān)研究進展緩慢。本論文研究探討了以對硝基乙酰苯胺作為CDA的底物、以對硝基苯胺作為CDA催化脫乙酰產(chǎn)物測定CDA活力的可能性,并建立了-種簡便、高效的酶活力測定方法。實驗考察了對硝基乙酰苯胺和對硝基苯胺的特征吸收峰；通過考察不同緩沖液體

2、系的紫外可見吸收波譜排除了緩沖液對酶活力測定的干擾；模擬酶解體系測定結(jié)果表明,建立的酶活測定方法具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。 以幾丁質(zhì)為唯一碳源,以對硝基乙酰苯胺為顏色指示劑,采用平板變色圈法,從15份土樣中篩選獲得459株菌,通過變色濾紙條檢驗法從459株菌株中得到使濾紙條變色較快、較深的菌株268株進行搖瓶發(fā)酵,測定發(fā)酵液的CDA酶活力,獲得一株產(chǎn)酶活力較高且性能穩(wěn)定的CDA產(chǎn)生菌11-3。測得菌株粗酶對膠體幾丁質(zhì)作用產(chǎn)物證實

3、有乙酸產(chǎn)生,說明該菌株產(chǎn)酶對膠體幾丁質(zhì)具有脫乙酰作用。通過BIOLOG細菌鑒定系統(tǒng)分析和16SrDNA序列分析,結(jié)合菌株11-3的培養(yǎng)特征及生理生化特征,鑒定菌株11-3為紅球菌屬(ghodococcus sp.),迄今為止未見該類菌產(chǎn)生CDA的研究報道。 研究確定了菌株11-3產(chǎn)酶的較優(yōu)培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件。菌株11-3發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基碳源以白砂糖最佳,氮源以蛋白胨最佳,并需要添加硫酸銨和玉米漿,乙酸鈉、磷酸二氫鉀對產(chǎn)酶有促進作

4、用,而乙酸銨、硫酸亞鐵對產(chǎn)酶則有抑制作用,硫酸鎂、氯化鈣、硫酸錳對產(chǎn)酶影響不大。產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)基組成(g/L)：蛋白胨2.5,白砂糖7.0,硫酸銨2.5,磷酸二氫鉀1.5,乙酸鈉2.0,玉米漿5.0。最佳培養(yǎng)條件為：250mL三角瓶裝液量30mL～35mL,發(fā)酵初始pH為7.5,種齡24h,接種量5％,培養(yǎng)溫度30℃,搖床轉(zhuǎn)速180r/min,發(fā)酵周期60h。產(chǎn)酶條件優(yōu)化后,菌株11-3產(chǎn)酶水平提高了近100倍,且性能穩(wěn)定,說明菌株11-

5、3是一支具有開發(fā)潛力的CDA生產(chǎn)菌株。 研究了菌株11-3的部分酶學(xué)性質(zhì)。菌株11-3粗酶具有較好的熱穩(wěn)定性,45℃保溫1h仍能保持90％以上的活力,酶的最適作用溫度為50℃：最適作用pH為7.0,在pH7.0-10.0之間有較高的活性,Ag+對該酶有較強的抑制作用。 本論文建立了一種簡便、高效的CDA酶活力測定方法,并利用該方法篩選獲得一支性能穩(wěn)定、產(chǎn)CDA活力較高、熱穩(wěn)定性好的紅球菌11-3,為進一步開展相關(guān)研究奠定