甲殼素脫乙酰酶產(chǎn)生菌的篩選、cDNA克隆及原核表達(dá)研究.pdf

1、論文內(nèi)容主要分為三個(gè)部分，第一部分側(cè)重于甲殼素脫乙酰酶(CDA)產(chǎn)生菌的篩選。 本文比較了幾種霉菌：總狀毛霉(Mucor racemosus)、青霉(Penicillium sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、根霉(Rhizopus sp.)菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期和穩(wěn)定期末期的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外CDA的酶活性。結(jié)果顯示：(1)各霉菌的胞內(nèi)和胞外都具有CDA活力，而且胞外的酶活力均大于胞內(nèi)的酶活力；(2)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期的

2、總狀毛霉菌株的CDA活力最高，其胞外酶活力達(dá)到97.2±4.2 U·(g干菌絲體)<'-1>，發(fā)酵菌株產(chǎn)酶總活力為83.1±3.6 U，均顯著高于其他菌株(P<0.5)。酶學(xué)特性研究表明：該酶的最適溫度為50℃，最適pH在7.2左右，低溫保存(4℃)穩(wěn)定性較差，每24小時(shí)酶活力下降30％以上。 第二部分著重從總狀毛霉中克隆CDA基因，并對(duì)其序列進(jìn)行分析。 從處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的總狀毛霉菌絲體中抽提得到總RNA，用已知真菌CD

3、A保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，進(jìn)行PT-PCR擴(kuò)增，結(jié)合RACE技術(shù)，分離和克隆到了2個(gè)總狀毛霉CDA的全長(zhǎng)cDNA，并進(jìn)行了全序列測(cè)定，提交GenBank，CDAl和CDA2的cDNA序列登錄號(hào)分別為DQ538514、DQ678929。再根據(jù)已知的cDNA序列設(shè)計(jì)基因特異性引物，以總狀毛霉全基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到了2個(gè)CDA基因的DNA片段，克隆并測(cè)序。CDA1和CDA2的DNA序列在Genbank的登錄號(hào)為EF468348、EF468

4、349。利用生物信息學(xué)的方法，對(duì)總狀毛霉的CDA1和CDA2的DNA及cDNA序列進(jìn)行分析和酶蛋白構(gòu)象預(yù)測(cè)，結(jié)果如下： (1)CDA1基因(cDNA)全長(zhǎng)為1506 bp，包括下列三部分：5’非翻譯區(qū)(67 bp)；閱讀框(1344 bp)，共編碼448個(gè)氨基酸殘基； 3’非翻譯區(qū)(95bp)，其中包含加尾信號(hào)AATAAA及Poly(A)。在該基因的DNA分子內(nèi)部(876～937bp)有一個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度為62bp，此內(nèi)含子的5’

5、和3’剪接位點(diǎn)符合GU—AG規(guī)則。 而CDA2基因(cDNA)全長(zhǎng)為1378 bp，分別為：5’非翻譯區(qū)(23 bp)；1254bp閱讀框，編碼418個(gè)氨基酸殘基；101bp 3’非翻譯區(qū)，其中包含了加尾信號(hào)AATAAA及Poly(A)。該基因的DNA分子中不含有內(nèi)含子序列。 (2)通過(guò)同源性搜索(Blastp)可知：CDA1和CDA2的cDNA中間部分均包含一由144個(gè)氨基酸殘基組成的多糖脫乙酰酶保守結(jié)構(gòu)域，約占總狀毛

6、霉CDA全長(zhǎng)的30％。該保守結(jié)構(gòu)域不僅存在于毛霉屬(Mucoraceae)微生物的CDA中，而且在其他真菌(如Saccharomyces cerevisiae)中存在，甚至在一些細(xì)菌(如Bacillus subtilis)的多糖脫乙(3)CDA1基因與其它相近種米根霉(Rhizopus oryzae)、卷柄根霉(Rhizopus circinans)的CDA1和CDA2、魯氏毛霉(Mucor rouxii)、卵形孢球托霉(Gongron

7、ella butleri)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、布拉克須霉(Phycomyces blakesleeanus)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的CDA1和CDA2基因的序列同源性分別為：75％、58％、56％、56％、48％、39％、39％、17％和16％；相應(yīng)的氨基酸序列的同源性分別為：69％、57％、59％、55％、47％、30％、32％、18％和21％。CDA2基因與該霉

8、的CDA1基因、其它相近種米根霉、卷柄根霉的CDA1和CDA2、魯氏毛霉、卵形孢球托霉、匍枝根霉、布拉克須霉、釀酒酵母的CDA1和CDA2基因的序列同源性分別為：55％、51％、55％、53％、68％、43％、35％、15％、 14％和H13％；相應(yīng)的氨基酸序列的同源性分別為：52％、52％、54％、49％、66％、47％、33％、32％、23％和24％。所以，真菌的CDA基因在進(jìn)化上并不保守。 (4)根據(jù)CDA基因推測(cè)所得氨基

9、酸序列構(gòu)建的不同真菌的系統(tǒng)樹(shù)，與采用經(jīng)典分類(lèi)法構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)基本一致。 (5)通過(guò)同源建模方法，預(yù)測(cè)了CDA1和CDA2基因所編碼的蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，驗(yàn)證了蛋白質(zhì)具有CDA完整的功能性結(jié)構(gòu)，并包含多糖脫乙酰酶結(jié)構(gòu)域，兩者具有相似的空間結(jié)構(gòu)。 (6)信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析表明：CDA1和CDA2推測(cè)蛋白質(zhì)的N-末端均存在信號(hào)肽，信號(hào)肽長(zhǎng)度分別為22和24個(gè)氨基酸殘基。 第三部分的主要內(nèi)容為將總狀毛霉CDA1和CDA2基因進(jìn)行

10、原核表達(dá)，并對(duì)重組蛋白純化、分析。 運(yùn)用基因重組的方法手段，將CDA1和CDA2基因構(gòu)建進(jìn)入原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a、pET22b、pET32a及pET43.1a，經(jīng)過(guò)PCR鑒定、雙酶切鑒定以及表達(dá)區(qū)域全部或部分序列測(cè)定，結(jié)果證實(shí)：已正確構(gòu)建了pET28a-CDA1、pET28a-CDA2、pET32a-CDA1、pET32a-CDA2、pET43.1a-CDA1、pET43.1a-CDA2、pET22b-CDA1及pET22b

11、-CDA2共8個(gè)重組質(zhì)粒。其中pET28a-CDA1、pET28a-CDA2的全序列測(cè)定表明：重組區(qū)域的CDA1基因(共1278bp)有4個(gè)堿基發(fā)生突變，兩個(gè)造成了氨基酸突變；而重組質(zhì)粒的CDA2基因(共1182bp)中也有2處堿基發(fā)生突變，其中之一的氨基酸序列也發(fā)生了突變，兩基因片段突變率均小于0.5％；在其余6個(gè)重組質(zhì)粒的表達(dá)基因接入?yún)^(qū)域，部分序列測(cè)定的結(jié)果顯示：CDA1和CDA2的基因(無(wú)內(nèi)含子)均已去除信號(hào)肽，并正確的接入了表達(dá)

12、區(qū)域，未產(chǎn)生移碼突變。 將8個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)，采用37℃、終濃度為0.5～lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。結(jié)果表明：重組質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)都成功地表達(dá)產(chǎn)生了蛋白質(zhì)，所得的重組蛋白或融合蛋白的分子量與預(yù)計(jì)的理論值相符。重組質(zhì)粒pET28a-CDA1、pET28a-CDA2、pET22b-CDA1及pET22b-CDA2表達(dá)的重組蛋白以包含體為主；而pET32a-CDA1、pET32a-CD

13、A2、pET43.1a-CDA1及pET43.1a-CDA2表達(dá)的融合蛋白仍以包含體為主，但已能電泳檢測(cè)到一定比例的司溶表達(dá)部分。利用親和層析可以分離、純化重組質(zhì)粒pET28a-CDA1、DET28a-CDA2表達(dá)的包含體蛋白質(zhì)。從誘導(dǎo)后表達(dá)的細(xì)胞中離心分離出包含體形式的重組蛋白，用6M鹽酸胍變性溶解后，專一性的結(jié)合在HisTrap(Ni<'2+>-Sepharose)親和柱，用6-0M脲線性梯度、使變性的重組蛋白在柱上重折疊，最后改變