紅花栝樓、木鱉子鯊烯合酶cDNA的克隆及木鱉子鯊烯合酶的原核表達(dá).pdf

1、本研究采用RT-PCR與RACE相結(jié)合的技術(shù)對(duì)葫蘆科植物紅花栝樓和木鱉子三萜合成通路關(guān)鍵酶鯊烯合酶cDNA進(jìn)行克隆，并對(duì)重組的木鱉子鯊烯合酶基因進(jìn)行原核表達(dá)。在此基礎(chǔ)上對(duì)紅花栝樓和木鱉子SS基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)獲得紅花栝樓鯊烯合酶基因cDNA序列。所獲得的紅花栝樓鯊烯合酶cDNA序列含有1466個(gè)核苷酸，其中包括含有1254個(gè)核苷酸的開放讀碼框序列，編碼417個(gè)氨基酸殘基。通過NCBI的Blast

2、比對(duì)，發(fā)現(xiàn)紅花栝樓SS基因編碼的氨基酸序列與已知植物SS基因編碼的氨基酸序列同源性為78％～94％，核苷酸的同源性為74％～93％。目前通過系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)紅花栝樓與羅漢果、絞股藍(lán)的親緣關(guān)系最近，這也證實(shí)葫蘆科植物鯊烯合酶基因的同源性，與預(yù)測結(jié)果相符合。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)葫蘆科植物與金鐵鎖SS基因親緣關(guān)系也比較近。根據(jù)NCBI采納的植物分類表，金鐵鎖屬于石竹科。形態(tài)學(xué)分類中，葫蘆科與石竹科處于不同分支，但SS的親緣關(guān)系需要進(jìn)一步探討。

3、　　(2)獲得木鱉子鯊烯合酶基因cDNA序列。所獲得的木鱉子鯊烯合酶cDNA基因序列共有1449個(gè)核苷酸，其中包括一個(gè)含有1254個(gè)核苷酸的開放讀碼框序列，編碼417個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子量約為47.8 kDa。通過NCBI的Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)木鱉子SS基因編碼的氨基酸序列與已知植物SS基因編碼的氨基酸序列同源性為80％～94％，核苷酸的同源性為73％～92％。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，木鱉子與紅花栝樓、羅漢果、絞股藍(lán)的親緣關(guān)系近，進(jìn)一步證實(shí)

4、葫蘆科植物鯊烯合酶基因的同源性，與預(yù)期結(jié)果相符。
　　(3)木鱉子鯊烯合酶基因原核表達(dá)。在得到木鱉子SS基因cDNA序列后，重新設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，克隆木鱉子SS基因cDNA讀碼框序列;將SS基因cDNA讀碼框架序列與表達(dá)載體pET32a(+)連接，成功構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a(+)-SS，并在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)出約66 kDa的目的融合蛋白，其中pET32a(+)表達(dá)標(biāo)簽大小約為18.3 kDa。