辣椒疫霉纖維素合酶CesA3基因的克隆、原核表達(dá)及遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、目前，辣椒疫病(pepper phytophthora blight)已成為影響辣椒生產(chǎn)的主要病害，不僅造成辣椒產(chǎn)量的降低，更給我國及其他國家?guī)砹藰O大的經(jīng)濟(jì)損失。辣椒疫病是由辣椒疫霉菌引起的，辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)能夠在土壤中長期存活且適應(yīng)性強(qiáng)，對于該病菌的防治當(dāng)前主要依賴農(nóng)藥。施用羧酸酰胺類(Carboxylicacid amides, CAAs)這一對卵菌病害防治效果杰出的殺菌劑，已

2、成為防治辣椒疫病的主要方法。該類殺菌劑由肉桂酰胺、纈氨酰胺氨基甲酸酯和扁桃酰胺類3組化學(xué)結(jié)構(gòu)各不相同的化合物組成。據(jù)已有的研究表明，這類殺菌劑的作用位點(diǎn)可能為編碼纖維素合酶復(fù)合體。
　　本研究即主要圍繞靶標(biāo)蛋白纖維素合酶CesA3展開。通過克隆基因、構(gòu)建表達(dá)載體等分子生物學(xué)手段，在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)該蛋白，并通過構(gòu)建多種原核表達(dá)載體和更換不同表達(dá)菌株，摸索該蛋白的最佳表達(dá)條件，為以后進(jìn)一步了解該蛋白特性打下基礎(chǔ)。普通浮萍(lemna

3、minor)是浮萍科植物的一種,為單子葉水生漂浮植物。由于浮萍根系在水中，與陸生植物相比較，對于水中溶解的化合物吸收效果更好。利用浮萍具有生長速度快、形態(tài)結(jié)構(gòu)簡單、生存環(huán)境條件易于控制的特點(diǎn)，本課題將浮萍應(yīng)用到農(nóng)藥生物測定工作中。通過使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在浮萍中表達(dá)外源細(xì)胞壁纖維素合酶，以轉(zhuǎn)基因浮萍為基礎(chǔ)，將傳統(tǒng)的種辣椒、接菌、施藥的農(nóng)藥生物學(xué)活性測定方法轉(zhuǎn)變?yōu)槭褂煤幣囵B(yǎng)液處理浮萍這種簡單的方式。在克隆了辣椒疫霉纖維素合酶基因CesA3基礎(chǔ)

4、上，將其與植物表達(dá)載體pCAMBIA1301連接，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法侵染浮萍愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)CesA3基因浮萍。經(jīng)抗生素篩選和分子鑒定，得多株穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系。RT-PCR結(jié)果顯示CesA3基因已在浮萍中轉(zhuǎn)錄。通過不同濃度梯度含烯酰嗎啉藥劑的Datko培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因株系一周，之后稱取浮萍干重。通過數(shù)據(jù)處理發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)CesA3基因的株系抗藥性高于野生型，進(jìn)一步測定葉綠素含量也得出相近的結(jié)論。這為建立以轉(zhuǎn)基因浮萍為檢測對象的農(nóng)藥生物學(xué)活性評