大青楊纖維素合酶基因的克隆與遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、纖維素是地球上含量最豐富的重要可再生資源,然而植物中纖維素的生物合成機(jī)制人們卻所知甚少。楊樹是林木分子生物學(xué)研究的模式植物,也是我國(guó)分布最廣的重要的速生材樹種之一,因此研究其纖維素生物合成的分子機(jī)理對(duì)于林木纖維素的分子改良具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究針對(duì)大青楊纖維素合酶.PuCesA6和PuCesA7進(jìn)行了研究,據(jù)報(bào)道PuCesA6基因與莖的伸長(zhǎng)有關(guān),而PuCesA7基因可能與初生壁的形成有關(guān)。
　　 以大青楊葉片為試驗(yàn)材料,

2、提取葉片總DNA,克隆出PuCesA6基因DNA全長(zhǎng)序列.5760 bp,與歐洲顫楊的PtrCesA6全長(zhǎng)cDNA的相似性為99％,含有13個(gè)外顯子共3812 bp及12個(gè)內(nèi)含子共1948 bp；克隆得到PuCesA7基因片段2341 bp,與歐洲顫楊的PtrCesA7全長(zhǎng)cDNA的相似性為98％。
　　 提取大青楊葉片總RNA,通過RT-PCR克隆了纖維素合成酶PuCesA6基因cDNA全長(zhǎng)序列及PuCesA7基因cDNA片段

3、。序列分析表明,PuCesA6基因cDNA全長(zhǎng)3778bp,包括5’UTR區(qū)66 bp,3’UTR區(qū)448 bp,開放讀碼框3264 bp,共編碼1087個(gè)氨基酸,該基因編碼蛋白的分子量為122.51 kDa,等電點(diǎn)為6.57；具有典型的植物纖維素合酶的高度保守特征:在N末端區(qū)有一鋅指狀結(jié)構(gòu),具有4個(gè)保守序列CxxC,隨后為一高變區(qū)(HVR-Ⅰ)和兩個(gè)跨膜區(qū)(TM),靠近C末端有另六個(gè)跨膜區(qū)(TM),在第二、第三跨膜區(qū)之間為另一高變區(qū)(

4、HVR—Ⅱ)和與β-糖苷轉(zhuǎn)移酶有關(guān)的保守序列Dx..xDxD及QxxRW。分子進(jìn)化分析表明PuCesA6蛋白與PtrCesA6蛋白親緣關(guān)系最近。
　　 將帶酶切位點(diǎn)的PuCesA6基因eDNA開放讀碼框序列與CaMV35S-sGFP-NOS瞬時(shí)表達(dá)載體重組,25℃暗培養(yǎng)2～4 h,并通過基因槍法轟擊洋蔥表皮細(xì)胞對(duì)PuCesA6蛋白進(jìn)行亞克隆定位,在Zeiss激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察GFP熒光在洋蔥表皮細(xì)胞中的位置,初步顯示GF

5、P熒光位于細(xì)胞壁或細(xì)胞膜上,隨后對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)壁分離處理,結(jié)果表明,PuCesA6蛋白定位于細(xì)胞膜上。
　　 設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物克隆 PuCesA6基因cDNA開放讀碼框序列,與植物表達(dá)載體pROKII重組,將重組后的全長(zhǎng)PuCesA6基因正義表達(dá)載體命名為pROKII-P6XbaIKpnI。以根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo),進(jìn)行煙草的基因轉(zhuǎn)化,確定了煙草轉(zhuǎn)化分化培養(yǎng)基類型,基本程序?yàn)轭A(yù)培養(yǎng)兩天、侵染5-10 min、共培養(yǎng)

6、2-4天、采用前期選擇、延遲選擇和后期選擇。共培養(yǎng)后選擇培養(yǎng)基中選擇壓為卡那霉素100 mg/L,農(nóng)桿菌抑菌劑為羧芐青霉素500 mg/L。提取在選擇培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的煙草苗的DNA,采用聯(lián)合PCR檢測(cè),即NPTII基因PCR檢測(cè)和目的基因PCR檢測(cè)。最后進(jìn)行Southern雜交檢測(cè),結(jié)果與聯(lián)合PCR檢測(cè)相符,陽(yáng)性植株有強(qiáng)烈的雜交信號(hào),陰性對(duì)照物雜交信號(hào)。與野生型煙草相比,正義轉(zhuǎn)基因煙草在植株形態(tài)上表現(xiàn)為株高生長(zhǎng)受到抑制,通過測(cè)量纖維細(xì)