長牡蠣(Crassostrea gigas)纖維素酶相關(guān)基因的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、纖維素是葡萄糖分子通過β-1,4-糖苷鍵連接形成的生物大分子。是植物細(xì)胞壁的主要組成成份,是世界上含量最豐富的生物資源。纖維素的降解主要是依靠纖維素酶的作用。纖維素酶主要由以下三種酶組成:內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纖維素首先在內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的作用下被切斷β-1,4-糖苷鍵形成纖維素糊精或者纖維二糖,然后在β-葡萄糖苷酶的作用下將纖維素糊精或者纖維二糖降解為葡萄糖。生物降解纖維素是各種酶的協(xié)同和逐步的反應(yīng),每

2、種酶在纖維素的降解中都發(fā)揮著重要的作用。
　　之前,一直認(rèn)為只有微生物例如細(xì)菌和真菌能夠降解和利用纖維素作為碳源。而高等動物是不能利用纖維素的,但是一些食草動物例外,例如反芻動物,它們利用纖維素是因為體內(nèi)與之共生的微生物的作用。一直認(rèn)為白蟻能夠消化纖維素是依靠體內(nèi)的共生菌,然而最新的研究發(fā)現(xiàn),白蟻體內(nèi)存在內(nèi)源性的纖維素酶。這以發(fā)現(xiàn)也說明了不僅僅是微生物能夠降解纖維素。之后,內(nèi)源性的纖維素酶基因在許多昆蟲和無脊椎動物中被發(fā)現(xiàn)。最近,

3、在軟體動物門中,也報道存在內(nèi)源性的纖維素酶。并且已經(jīng)在紫貽貝(Mytilus edulis)、皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)、福壽螺(Ampullaria crossean)、日本河蜆(Corbiculajaponica)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了β-葡萄糖苷酶基因。但是還沒有報道在長牡蠣體內(nèi)存在纖維素消化酶。
　　本實驗通過同源克隆和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)成功地從長牡蠣體內(nèi)克隆了內(nèi)切葡聚糖酶基因和β-葡萄

4、糖苷酶基因,并對基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)特性進(jìn)行了分析。
　　1.長牡蠣內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆和表達(dá)分析
　　內(nèi)切葡聚糖酶cDNA全長802 bp,開放閱讀框架630 bp,編碼209個氨基酸?；蚪MDNA全長5056bp,含有兩段內(nèi)含子長度分別為2053bp和2313bp。cDNA具有與己發(fā)現(xiàn)的內(nèi)切葡聚糖酶基因相同的保守區(qū)結(jié)構(gòu)和功能域,并且與其他已知貝類的內(nèi)切葡聚糖酶有較高的同源性,含有糖基水解酶第45家族的保守結(jié)構(gòu)域。利用RT-

5、PCR方法研究了該基因在長牡蠣消化腺、外套膜、鰓、肌肉、性腺和唇瓣組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)冉切葡聚糖酶基因只在消化腺中表達(dá),而在其他組織中沒有表達(dá)。
　　2.長牡蠣β-葡萄糖苷酶基因的克隆和表達(dá)分析
　　β-葡萄糖苷酶cDNA全長2052bp,開放閱讀框架1347 bp,編碼448個氨基酸。cDNA具有與已發(fā)現(xiàn)的β-葡萄糖苷酶基因相同的保守區(qū)結(jié)構(gòu)和功能域,并含有糖基水解酶第一家族(GHF-1)的保守區(qū)間。利用RT-PCR方法研究了