長(zhǎng)牡蠣酪氨酸酶基因家族的克隆、表達(dá)和系統(tǒng)發(fā)生分析.pdf

1、本論文以我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖貝類長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas;又稱太平洋牡蠣)為研究對(duì)象,克隆了一個(gè)長(zhǎng)牡蠣酪氨酸酶基因,分析了其組織表達(dá)特性以及進(jìn)化地位,并開展了長(zhǎng)牡蠣基因家族的分類、系統(tǒng)進(jìn)化研究。本文的研究?jī)?nèi)容和主要研究結(jié)果如下:
　　1.長(zhǎng)牡蠣酪氨酸酶基因CgTyr2的克隆及其特性分析
　　以長(zhǎng)牡蠣成貝為實(shí)驗(yàn)材料,利用長(zhǎng)牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)計(jì)引物,得到中心片段后,經(jīng)過3’RACE和5’RACE,從長(zhǎng)牡蠣外套膜

2、中擴(kuò)增出酪氨酸酶 CgTyr2全長(zhǎng)基因。長(zhǎng)牡蠣酪氨酸酶基因 CgTyr2的 cDNA全長(zhǎng)為2563bp,開放閱讀框2100bp。編碼299個(gè)蛋白質(zhì),分子量為77.4KDa,理論等電點(diǎn)為-3.3。BLAST分析表明,長(zhǎng)牡蠣酪氨酸序列與已知貝類的酪氨酸酶基因具有較高的同源性。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,血藍(lán)蛋白是由原始的酪氨酸酶基因復(fù)制并伴隨功能分化形成的。長(zhǎng)牡蠣以及其他軟體動(dòng)物的酪氨酸酶基因家族的形成可能是由酪氨酸酶在軟體動(dòng)物分化形成前后復(fù)制得到。

3、熒光定量 PCR分析顯示,長(zhǎng)牡蠣酪氨酸酶基因CgTyr2在各個(gè)組織中都有表達(dá),其中外套膜外層表達(dá)量最高,可能與長(zhǎng)牡蠣角質(zhì)層的形成以及貝殼著色有關(guān)。
　　2長(zhǎng)牡蠣部分酪氨酸酶基因家族中心片段的克隆及分析
　　利用長(zhǎng)牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫(kù),通過 BLAST比對(duì),得到預(yù)測(cè)的長(zhǎng)牡蠣酪氨酸酶基因家族序列 OYG_10017214、 OYG_10011916、 OYG_10021075和OYG_10026226。分別對(duì)應(yīng)14TYR、16TYR

4、、75TYR和26TYR,設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增另外四個(gè)酪氨酸酶基因核心片段。通過tblastx比對(duì),與14TYR和16TYR最相近的酪氨酸酶均為馬氏珠母貝酪氨酸類似蛋白1(Accession No. KC870906.1);與75TYR和26TYR最相近的酪氨酸酶均為馬氏珠母貝酪氨酸酶類似蛋白2(Accession No. KC912764.1)。
　　3長(zhǎng)牡蠣酪氨酸酶基因家族的分類和系統(tǒng)發(fā)生分析
　　利用生物信息學(xué)方法對(duì)長(zhǎng)牡蠣酪

5、氨酸酶基因家族的氨基酸序列特征、分類及系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)行分析。結(jié)果表明,長(zhǎng)牡蠣酪氨酸酶基因家族在進(jìn)化過程中存在基因擴(kuò)張現(xiàn)象,其主要方式是基因重復(fù)。長(zhǎng)牡蠣酪氨酸酶可分為3種類型:分泌型(Type A),胞內(nèi)型(Type B)和具跨膜結(jié)構(gòu)域型(Type C)。系統(tǒng)發(fā)生樹分析發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)牡蠣酪氨酸酶的聚類受酪氨酸酶類型以及基因位置的影響,其分泌型酪氨酸酶首先與頭足類分泌型酪氨酸酶聚在一起,然后與線形動(dòng)物門分泌型酪氨酸酶聚在一起,與腔腸動(dòng)物門分泌型酪氨酸酶