丹參迷迭香酸代謝酪氨酸支路重要基因克隆及調(diào)控分析.pdf

1、迷迭香酸(Rosmarinic acid，RA)在植物中分布廣泛，主要存在于唇形科和紫草科植物中，具有抗炎、抗菌、抗氧化等生理活性。對植物中迷迭香酸次生代謝途徑研究表明，該代謝途徑包括分別以苯丙氨酸和酪氨酸為前體的兩條平行支路，各經(jīng)過幾步酶促反應(yīng)生成 4-香豆酰-Co-A和3，4-二羥基苯乳酸，二者在迷迭香酸合成酶(Rosmarinic acid synthase，RAS)的作用下生成迷迭香酸。 丹參 (Salvia milti

2、orrhiza Bunge)為歷代常用中藥，根和根莖入藥。從20世紀(jì)90年代以來，以迷迭香酸和丹參酚酸B為代表的水溶性活性成分成為研究的熱點。然而迄今關(guān)于丹參中迷迭香酸次生代謝途徑報道較少，使研究丹參迷迭香酸的次生代謝途徑及調(diào)控和生物工程改良丹參種質(zhì)資源存在瓶頸。 本研究采用cDNA末端快速擴(kuò)增 (Rapid amplification of cDNA ends，RACE)和基因組步移(Genomic DNA walking)技

3、術(shù)，首次從丹參植物中克隆得到迷迭香酸次生代謝途徑酪氨酸支路上的三個相關(guān)基因：酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因(Tyrosine aminotransferase gene，SmTAT)、對羥基苯丙酮酸還原酶基因(4-hydroxyphenylpylpyruvate reductase gene，SmHPPR)和對羥基苯丙酮酸雙氧化酶基因(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase gene，SmHPPD)的全長cDNA序

4、列和基因組DNA序列。對各基因的研究如下： 1、SmTA瑾因：根據(jù)其它物種中的TAT的基因序列，選擇保守區(qū)域設(shè)計特異性引物克隆出丹參的SmTAT的cDNA全長序列及基因組DNA序列。cDNA序列全長1603 bp，包含一個完整的1233 bp的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼411個氨基酸殘基。根據(jù)蛋白比對的結(jié)果，SmTAT基因編碼的氨基酸序列與其它物種中報道的已知TAT蛋白序列具有高度的同源性。

5、SmTAT基因組序列包含6個外顯子和5個內(nèi)含子，其啟動子和終止子包含多個基因調(diào)控元件。該基因在丹參中為組成性表達(dá)，且莖中的表達(dá)比葉和根高。內(nèi)源性植物激素信號分子及外界刺激，如甲基茉莉酸(Methyl jasmonic acid，MeJA)、脫落酸(Abscisic acid，ABA)、水楊酸(Salicylic acid，SA)和紫外照射(Ultraviolet-B radiation，UV-B)處理分別在一定程度上上調(diào)SmTAT轉(zhuǎn)錄水

6、平的表達(dá)。 2、SmHPPR基因：對羥基苯丙酮酸還原酶 (4-hydroxyphenylpylpyruvatereductase，HPPR)是迷迭香酸生物合成途徑的第一個特異的關(guān)鍵酶。SmHPPR基因cDNA序列全長1066 bp，包含一個長度為939 bp，編碼313個氨基酸殘基的ORF?；蚪MDNA揭示含有2個外顯子和1個內(nèi)含子。SmHPPR基因編碼的蛋白含有右旋-2-羥酸脫氫酶家族蛋白的兩個典型結(jié)構(gòu)域，與彩葉草中HPPR蛋

7、白的一級、二級和三級結(jié)構(gòu)均具有很高的相似性。SmHPPR啟動子和終止子分析，含有多個基因調(diào)控元件。該基因在丹參根莖葉器官中為組成性表達(dá)，莖中最強(qiáng)，根次之，葉相對較弱。各種刺激考察顯示MeJA，SA，ABA和赤霉素(Gibberellic acid，GA<,3>)能上調(diào)SmHPPR轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，UV-B和雙氧水(Hydrogen peroxide，H<,2>O<,2>)處理能下調(diào)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，提示該基因亦可能受茉莉酸、脫落酸、水楊酸及活

8、性氧族信號調(diào)控途徑的影響。 3、SmHPPD基因：對羥基苯丙酮酸雙氧化酶(4-hydroxyphenvlpyruvatedioxygenase，HPPD)與HPPR共有相同的催化底物，為迷迭香酸生物合成途徑的一個旁路位點進(jìn)入酶，催化對羥基苯丙酮酸轉(zhuǎn)化成尿黑酸，最終形成植物光合作用中電子傳遞所必需的質(zhì)體醌和生育酚。根據(jù)其它物種中HPPD的基因序列，首次從丹參中克隆得到HPPD的cDNA全長序列及基因組DNA序列。cDNA序列全長1

9、736 bp，包含一個完整的1443 bp的ORF，編碼481個氨基酸殘基。根據(jù)蛋白比對的結(jié)果，SmHPPD基因編碼的氨基酸序列與其它物種中報道的已知HPPD蛋白序列具有高度的同源性。SmHPPD基因組序列包含2個外顯子和1個內(nèi)含子，其啟動子和終止子包含多個基因調(diào)控元件。該基因在丹參中為組成性表達(dá)，且根和葉比莖中的表達(dá)高。UV-B、暗處理與自然光對照，結(jié)果顯示，UV-B可抑制SmHPPD的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 酪氨酸支路三個代謝基因的克隆