丹參基因工程體系創(chuàng)新優(yōu)化及次生代謝調(diào)控應(yīng)用研究.pdf

1、丹參是重要的藥用植物模式材料，也是需求較大的中藥材，其丹酚酸和丹參酮類等次生代謝產(chǎn)物有效成分具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌消炎、降血脂等多種藥用活性并被廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療高血脂、心腦血管和急性缺血性中風(fēng)等疾病。隨著心腦血管疾病發(fā)病率升高及日常保健意識(shí)的增強(qiáng)，丹參需求量逐年快速增加，野生丹參資源日漸枯竭，而栽培丹參供應(yīng)及品質(zhì)難以滿足，且通過化學(xué)合成制備丹參次生代謝產(chǎn)物可行性較低。因此，基于基因工程策略改善丹參品質(zhì)、提高有效成分含量日益

2、引起研究者的關(guān)注。
　　本文針對(duì)丹參基因工程有效實(shí)施的關(guān)鍵環(huán)節(jié)展開工作，首先構(gòu)建基于Bsata除草劑抗性的葉盤穩(wěn)定轉(zhuǎn)化再生體系及基于rolABC因子的毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，在此基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)錄因子AtEDT1過表達(dá)、丹酚酸合成代謝旁路基因SmHPPD和SmCCR抑制表達(dá)及多胺代謝調(diào)控基因SmSAMDC過表達(dá)的策略，分析丹參酮、丹酚酸等丹參主要次生代謝成分積累規(guī)律，為有效應(yīng)用基因工程策略改善丹參品質(zhì)、有效滿足供給提供研究思路、調(diào)控節(jié)點(diǎn)

3、、關(guān)鍵原件及基礎(chǔ)材料。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　1.建立了 Basta除草劑為選擇標(biāo)記的丹參遺傳轉(zhuǎn)化再生體系：首先通過梯度設(shè)置Basta濃度，最終確定0.6 mg/L的Basta濃度作為最適丹參選擇壓；進(jìn)而構(gòu)建35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Basta抗性基因的T-DNA骨架載體，并優(yōu)化預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、誘導(dǎo)再生等培養(yǎng)環(huán)節(jié)參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了基于Basta除草劑選擇的丹參農(nóng)桿菌介導(dǎo)的有效轉(zhuǎn)化再生；經(jīng)過T-DNA目標(biāo)PCR擴(kuò)增及GUS組織化學(xué)染

4、色，確認(rèn)了轉(zhuǎn)化子的有效性，為二次轉(zhuǎn)化創(chuàng)制雙抗材料提供了基礎(chǔ)材料。
　　2.針對(duì)發(fā)根質(zhì)粒誘導(dǎo)毛狀根再生的關(guān)鍵基因簇rolABC，構(gòu)建rolA、rolB、rolC單基因及rolABC多基因丹參毛狀根誘導(dǎo)體系，以避免農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒T-DNA區(qū)域冗余基因?qū)χ参锩珷罡紊x系統(tǒng)的干擾，最大限度有效應(yīng)用毛狀根系統(tǒng)進(jìn)行丹參次生代謝工程研究。
　　3.構(gòu)建基于 Basta除草劑抗性選擇的擬南芥轉(zhuǎn)錄因子 AtEDT1（Arabidopsis

5、 thaliana Enhanced Drought Tolerance1）過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制AtEDT1過表達(dá)丹參轉(zhuǎn)化材料。栽培實(shí)驗(yàn)表明，丹參AtEDT1轉(zhuǎn)化株系表現(xiàn)了明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，特別是在逆境脅迫條件下，生長(zhǎng)量顯著優(yōu)于對(duì)照材料。進(jìn)一步研究顯示，丹參AtEDT1轉(zhuǎn)化材料中，轉(zhuǎn)AtEDT1丹參根系中，丹酚酸合成代謝相關(guān)基因（SmTAT、SmHPPR、SmPAL、SmC4H、Sm4CL和SmRAS）的表達(dá)水平明顯

6、提升。與其對(duì)應(yīng)，轉(zhuǎn)基因材料根系中丹酚酸類化合物（迷迭香酸、紫草酸及丹酚酸B）的合成積累也相應(yīng)增加，轉(zhuǎn)基因株系 SmTAT基因的表達(dá)水平高達(dá)野生型丹參的6倍，丹酚酸 B的含量增加至61.9mg/g約為野生型丹參的1.55倍。同時(shí)，過表達(dá)AtEDT1也對(duì)丹參酮合成途徑調(diào)控基因（SmHMGR、SmMDS和SmIPPI）表達(dá)水平表現(xiàn)為多樣調(diào)控效果，轉(zhuǎn)基因株系中丹參酮類化合物（隱丹參酮、二氫丹參酮I和丹參酮IIA）的合成積累也呈現(xiàn)不同積累水平。<

7、br>　　4.基于丹參毛狀根誘導(dǎo)體系，驗(yàn)證了MIGS（miRNA-induced gene silencing）技術(shù)在丹參基因功能研究中的有效性。進(jìn)而針對(duì)丹參酚酸合成旁路基因 SmHPPD和SmCCR構(gòu)建單基因及多基因MIGS抑制表達(dá)載體，基于丹參毛狀根轉(zhuǎn)化體系，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因的有效沉默。相對(duì)于對(duì)照材料，SmHPPD和SmCCR抑制表達(dá)毛狀根形態(tài)及生長(zhǎng)沒有明顯差異，但丹酚酸類化合物積累水平（特別是迷迭香酸）顯著提高。
　　5.針對(duì)

8、丹參多胺合成代謝關(guān)鍵基因SmSAMDC，分析了其組織特異性表達(dá)模式，進(jìn)而構(gòu)建了基于Basta除草劑選擇的過表達(dá)載體，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制丹參 SmSAMDC過表達(dá)新材料，嘗試通過調(diào)控多胺生成進(jìn)行丹參次生代謝產(chǎn)物調(diào)控。轉(zhuǎn)基因分子、表型鑒定表明，受體丹參轉(zhuǎn)化材料明確整合有包含SmSAMDC表達(dá)單元的 T-DNA，但沒有明顯的目標(biāo)性狀體現(xiàn)?？紤]到同源轉(zhuǎn)化中普遍存在的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象，我們以煙草為轉(zhuǎn)化受體材料進(jìn)行 SmSAMDC異源表達(dá)分

9、析，發(fā)現(xiàn)煙草SmSAMDC異源表達(dá)材料在干旱脅迫條件下，通過SmSAMDC異源表達(dá)可顯著提升受體植物材料相對(duì)含水量及抗氧化活性，為 SmSAMDC在丹參代謝工程中有效應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　基于以上研究工作，本研究有效拓展了丹參遺傳轉(zhuǎn)化平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了基于轉(zhuǎn)錄因子AtEDT1過表達(dá)及丹酚酸合成代謝旁路基因SmHPPD、SmCCR抑制表達(dá)策略的丹參次生代謝產(chǎn)物調(diào)控，并對(duì)丹參多胺代謝調(diào)控基因 SmSAMDC的表達(dá)特性及功能進(jìn)行了研究。本