脫氮基因工程菌PNS的構(gòu)建及其應用研究.pdf

1、目的：采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建脫氮基因工程菌PNS，使其高效表達cd1-亞硝酸鹽還原酶，催化同步硝化反硝化脫氮工藝中最關(guān)鍵的限速步驟，從而加速脫氮進程，提高脫氮效率，降低脫氮成本。 方法：本研究所采用的實驗方法如下： 1．根據(jù)GenBank公布的nirS堿基序列和表達載體pQE-30的多克隆位點設計引物，以銅綠假單胞菌PAO1的基因組DNA為模板，應用PCR技術(shù)擴增目的片段nirS；之后經(jīng)過BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，

2、定向克隆到pQE-30上，化學轉(zhuǎn)化 DH5α，構(gòu)建含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子pQE30-nirS-DH5α； 2．經(jīng)酶切和測序鑒定后，將重組質(zhì)粒pQE30-nirS轉(zhuǎn)化表達菌株SG13009，構(gòu)建脫氮基因工程菌PNS，再用SDS-PAGE和His-tag in-gelStain鑒定PNS所表達的外源性蛋白(cd1-NIR)的分子量和特異性； 3．為了使PNS能夠在實際的污水環(huán)境中發(fā)揮高效的脫氮功能，又對其在厭氧和20℃低溫

3、環(huán)境中的表達情況進行了科學和詳實的分析，同時也對誘導劑IPTG的最佳誘導濃度和最適誘導時間進行了合理的優(yōu)化。 結(jié)果：本研究通過上述實驗所取得的主要結(jié)果如下： 1．應用PCR技術(shù)成功擴增了編碼cd1-NIR的nirS基因；經(jīng)過雙酶切和定向克隆，成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒 pQE30-nirS；經(jīng)過測序和BLAST顯示，表達質(zhì)粒pQE-30中的插入序列與GenBank公布的基因序列完全一致。 2．將重組表達質(zhì)粒pQE

4、30-nirS轉(zhuǎn)化表達菌株SG13009，經(jīng)SDS-PAGE的分子量鑒定和His-tag in-gel Stain的特異性鑒定，成功構(gòu)建了脫氮基因工程茵 PNS。 3．在厭氧和低溫的環(huán)境中，重組蛋白 cd1-NIR 均獲得了較高水平的表達；同時通過蛋白質(zhì)表達形式的分析顯示，在厭氧和低溫的環(huán)境中，PNS所表達的可溶性 cd1-亞硝酸鹽還原酶的百分比均大于其最適的生長環(huán)境。 結(jié)論：成功構(gòu)建了高效表達cd1-亞硝酸鹽還原酶